[发明专利]细胞凋亡的特异性量化检测

权利要求书

1. 一种用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒包括：

用于DNA的3'末端标记的末端转移酶（Terminal transferase， TdT）；

未进行标记的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP），用于细胞膜通透后断裂的DNA片段3'末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）中的碱基而得到预先标记。

2. 根据权利要求1所述的用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为：

KCl 10-100 mM；

Tris-HCl   1-100 mM；

MgCl₂   1-100 mM；

DTT，pH 7.9   0.1-10 mM；

TdT 1-500U；

未标记的ddCTP 10-1000μM； 

荧光标记的dUTP   0.01-100nM。

3. 根据权利要求1所述的用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为：

KCl 10-100 mM；

Tris-HCl   1-100 mM；

MgCl2  1-100 mM；

DTT，pH 7.9   0.1-10 mM；

TdT 1-500U；

未标记的dCTP  1-100nM；

荧光标记的dUTP   0.01-100nM。

4. 根据权利要求1所述的用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为：KCl   50 mM；Tris-HCl   20 mM；MgCl₂    10 mM；DTT，pH 7.9   1mM；TdT    50U；未标记的ddCTP   10-1000μM；荧光标记的dUTP  0.01-100nM。

5. 根据权利要求1所述的用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）选自ddATP、ddGTP 、ddCTP、ddTTP的一种，且ddNTP的反应终浓度为500μM；所述三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）选自dATP、dGTP、dCTP、dTTP的一种; 且dNTP的反应终浓度为10nM。

6. 一种利用权利要求1～5任意一项所述的细胞预孵育试剂盒进行检测细胞凋亡的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）将待检测细胞在具有权利要求1~5任意一项所述的细胞预孵育试剂盒的条件下在离体培养液中进行预孵育，预孵育的温度为37℃，孵育时间为1小时，在进行孵育的同时对待检测细胞进行细胞膜通透化处理；

（2）在孵育后的待检测细胞离体培养液中加入荧光标记的dUTP进行末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记（TUNEL试验），dUTP终浓度为10nM；

（3）检测孵育后的待检测细胞中荧光标记信号强度；通过检测得到的荧光标记信号强度和确定待检测细胞中细胞凋亡状况。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中待检测细胞为HT-29细胞，所述荧光标记信号强度通过激光扫描细胞流式仪（LSC）来测定。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）中采用的细胞膜通透化处理的试剂为DNase I和Triton X-100；先用5~20μg/ml 的DNase I进行待检测细胞的孵育后，用0.1~1% Triton X-100对细胞膜脂质进行溶解处理，处理时间为10分钟，处理温度为37℃。

9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）中荧光标记的dUTP为Cy5-dUTP或FITC-dUTP。

10. 一种权利要求1~5任意一项所述的细胞预孵育试剂盒在检测细胞凋亡方面的应用。