[发明专利]细胞凋亡的特异性量化检测

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞凋亡的特异性量化检测技术。

背景技术

细胞凋亡是一个受到严密调控的通路，其目的在于当机体处于一系列包括肿瘤压力的生物学过程时，清除机体不需要的细胞。因此，当机体的正常细胞凋亡途径出现紊乱时，凋亡异常调控就成为了肿瘤发生的一个主要机理。更重要的是，细胞凋亡的水平已经不仅成为了检测癌症治疗效果的强有力标记，也成为了预测临床治疗预后的重要标记。因此，更精确的细胞凋亡检测技术的开发就成为了肿瘤生物标记物发现中一个关键的必要环节。

原位末端转移酶标记技术(TUNEL)是用于检测凋亡细胞中的原位DNA降解的常用方法，其原理在于核染色质的断裂是细胞凋亡晚期的标志之一，会导致DNA双链产生大量3′-羟基末端，因此可以利用这个性质来鉴定凋亡细胞。具体做法是通过荧光标记的脱氧鸟苷酸(F-dUTP)对DNA断裂处进行标记来鉴定的。脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)可以利用DNA链上暴露的3′-羟基末端催化不依赖模板的脱氧核苷酸到双链DNA或者单链DNA的3′-羟基末端从而生成双链DNA。另外，脱氧胸腺嘧啶核苷类似物5-溴代-2′-脱氧鸟苷5′-三磷酸(BrdUTP)也适用于TdT反应来标记断裂位点。BrdU一结合到DNA中，就可以通过一种抗BrdU抗体通过免疫组化技术进行检测。非凋亡细胞就没有结合大量F-dUTP的能力，因为这类细胞缺少暴露的DNA 3′-羟基末端。然而，近年来随着细胞凋亡技术的发展，对TUNEL技术的精确性出现了越来越多的争论，主要原因在于这项技术会错误地将坏死细胞也标记为凋亡细胞，例如原位末端转移酶标记技术不能区分细胞凋亡、细胞坏死和细胞自溶。近年来已经有一些改善原位末端转移酶标记技术的敏感性和非特异性的研究进展。例如，细胞经过微波辐照预处理紧随着蛋白酶K进行消化处理后，检测结果显示可以大大改善检测的敏感性和特异性。然而，这些改善仅在正在培养的细胞中起作用，而对检测细胞凋亡、细胞坏死和组织切片等引起的非特异性DNA断裂不起任何作用。利用形态学分析方法去辨认凋亡细胞确实可以帮助改善特异性，但是这使得整个过程费时又费力。而且，细胞凋亡形态的评定是一个主观性的鉴定过程。所以，迫切需要一种可以特异性地检测和测量由于凋亡特异性的DNA片段碎裂而不是由坏死或者非特异性断裂引起的DNA片段碎裂的技术方法。

在肿瘤活组织检查中，由肿瘤治疗诱导的DNA片段碎裂已经成为一种重要的预测肿瘤临床反应的标志。因此，可以准确和可重复性地检测凋亡特异性的DNA碎片的方法具有至关重要的作用。不幸的是，商业上可用的原位末端转移酶标记技术(TUNEL)不仅会检测出由于细胞凋亡导致的DNA碎片，还会检测出由组织切片引起的非特异性DNA断裂产生的DNA片段碎裂，因此研发特异检测细胞凋亡的技术具有十分重要的意义。本发明正基于以上的思路而来。

发明内容

基于上述问题的迫切性，本发明提供了一种新的凋亡检测技术，该技术可以准确并可重复地检测凋亡特异性的DNA碎片断裂。利用这种技术在肿瘤活组织检测中可以提高细胞凋亡检测的准确性，从而可以预测治疗效率和治疗结果，它也将在临床检查和基础实验研究中提高检测细胞凋亡的特异性。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种用于检测细胞凋亡的细胞预孵育试剂盒，其特征在于所述细胞预孵育试剂盒包括：

用于DNA的3′末端标记的末端转移酶(Terminal transferase，TdT)；

未进行标记的双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)，用于细胞膜通透后断裂的DNA片段3′末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷对(dNTP)中的碱基而得到预先标记。

优选的，所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为：

KCl         10-100mM；

Tris-HCl    1-100mM；

MgCl₂              1-100mM；

DTT，pH 7.9        0.1-10mM；

TdT                1-500U；

未标记的ddCTP      10-1000μM；

荧光标记的dUTP     0.01-100nM。

优选的，所述细胞预孵育试剂盒以其组分的反应终浓度计为：