[发明专利]一种花粉管介导的玉米原位转基因方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物和现代农业技术领域，涉及一种玉米原位转基因方法。

背景技术

基因工程作物品种改良和功能基因组研究需要高效的植物转基因技术(转化技术)。玉米是我国主要作物，也是世界的主要作物。应用转基因技术进行品种改良已取得许多成果。但现有转化技术水平还需要改进、创新和发展。

目前国际上常用的玉米转基因方法主要是基因枪和农杆菌介导法。农杆菌介导的转化方法比基因枪法拷贝数低，具有优越性。然而，用这两个技术的成功转化须建立在受体称之为II型胚性愈伤组织基础之上。但是II型胚性愈伤组织的诱导明显受到基因型的限制，能诱导较高频率II型胚性愈伤组织的基因型目前现在世界上虽在A188等少数材料基础上有所扩展，但大多数材料还不能诱导出II型胚性愈伤组织，或诱导率低，容易丧失胚性。

另一方面，这种基于组织培养技术进行的植物细胞转化，继而通过转化细胞再生达到获得转基因植物的技术，要得到同一基因背景细胞形成的转基因个体，必须在单细胞水平获得转化，然后通过克隆、分化以至产生植株。然而许多植物在组织培养水平是不容易保持完全的细胞一致性，也很难产生单细胞来源的体细胞克隆及背景一致的转基因植株。

以生殖系统的可遗传单细胞为受体，是很多研究者正在关注的方法。

高等植物的合子是体内个体发育的第一个细胞，具有易分裂和形成胚的能力。子房注射法是用微玻针把外源DNA注射到子房或胚珠中，使其在受精前后或合子胚的旺盛分裂期进入细胞，进而整合到基因组中。王景雪等(2001)用子房注射方法成功地将几丁质酶基因导入到玉米自交系中。但这种方法操作具有盲目性，经验性很强，要一个一个子房操作，好多因素影响转化效率，重复性差。直接以合子为受体的转化，首先建立在合子的分离和体外培养基础上，由于分离和培养技术需要实验室条件及操作人员技能，这种依赖实验室条件的合子转化同样受到限制。刘德璞(2005)发明了用农杆菌侵染活体植株合子的合子原位转化技术，大大提高了以合子为受体的转基因频率和成功率。

通过转化花粉，然后用转化的花粉给受体植株授粉，得到转基因种子，不同的种子即可以携带不同DNA背景，一次转化操作可以得到多个不同的转基因个体，更有优越性。以花粉为受体的转化，现使用较多的是，在体外通过各种物理手段向花粉注入外源DNA分子，如基因枪轰击花粉，超声波处理花粉，再用轰击和处理过的花粉给雌穗授粉。这种方法由于体外处理的影响，结实率低，转化率也不高。

再一种是农杆菌浸花技术(Agrobacterium-mediated floral dipping method)。最早几年，在拟南芥、白菜、苜蓿、萝卜上有成功报道(张广辉等，1998；Cao等，2000；Trieu等，2000；Curtis等，2001)，在作物上应用的成功事例较少。近几年，在黑麦和小麦的遗传转化上的研究结果证实，这种遗传转化方法在禾本科麦类作物是可行的。在拟南芥中的研究进展，说明农杆菌浸染的目的受体是胚珠，证实转化时间发生在授粉前。

发明内容

本发明要解决的技术问题是公开一种由农杆菌和花粉管共介导的玉米原位转基因方法，即用农杆菌原位侵染已长出的花粉管，实现花粉的遗传转化，再以转化的花粉继续实现自然的受精作用，从而获得转化子种子。

本发明要解决的技术方案由以下步骤实现：

1、种植受体玉米，按正常管理至开花期；

2、菌种准备，平板菌种贮藏于4℃冰箱，每周活化一次，一个月后用YEP液体培养基于21℃培养三天至对数期，OD₆₀₀＝1，离心取出菌体，重悬至侵染培养基，调节密度在OD₆₀₀＝0.7-1，23-25℃摇床培养4-5小时，制成感染液，用来侵染；

3、转化操作，在20-25℃天气温度操作，用剪刀将距离雌穗顶端1cm的花丝剪平，将感染液注入包叶内，滴入量2-4ml，套上纸袋，经过1.5小时后人工授粉，授粉时，为使较多花粉授粉，将花丝分开，然后授粉，随即套袋再次隔离，管理至结实成熟；

4、收获及筛选转化子。待玉米成熟后收获，筛选时，将种子用筛选剂溶液处理，然后播于蛭石介质的盘中筛选，或待出苗后涂抹叶片，选出抗性苗，经分子检测获得阳性株后，移栽至大花盆或直接进入田间。

本发明对于以往的技术，有四方面创新：