[发明专利]一种微量、复杂DNA的扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微量、复杂DNA的扩增方法，尤其涉及一种微量DNA、或者单细胞或微量细胞全基因组DNA的高灵敏、高保真、高均一、高效率的扩增技术，以及海藻糖在所述全基因组DNA扩增中的应用。

背景技术

微量模板DNA的检测，是很多领域迫切需要解决的一个难题。因为DNA量不足，用现有的技术手段常无法检测成功。PCR技术的发展和应用使得微量甚至单个细胞的DNA分析成为可能，极大地促进了法医学、古生物学、分子诊断学和分子病理学的发展。但即便是对于非常敏感的PCR技术，许多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或几次PCR反应。另一方面，PCR特长于特定的较短的（一般数千碱基对kbs以下）而且单一的特定DNA序列，PCR在复杂DNA、尤其是长片断的复杂DNA全库（全谱）扩增方面有诸多的先天不足。为能从少量细胞中最大限度的获取信息，全基因组扩增技术应运而生。

全基因组扩增技术（WGA）是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量，可对非常微量的DNA进行均衡的扩增获得大量DNA，故被认为是目前解决这一难题的一种基本方法，已被广泛用于法医学、单基因遗传病的诊断及疾病基因的分析等领域研究。

单细胞基因组学是包括单细胞全基因组测序，和以单细胞和微量细胞为材料的全基因组范围内的基因功能(功能基因组学)研究技术，这些技术的完善一方面为细胞水平的生命功能研究提供了基础，另一方面也成为下一代基因水平疾病诊断和治疗的方法与技术的基础。

单细胞和微量细胞WGA是单细胞全基因组学的前提与基础，而扩增效率和保真性是衡量WGA技术优劣的主要指标。多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）和滚环扩增(Rolling cycle amplification，RCA)是一种扩增效率高、保真性能好的新兴WGA 技术。该技术一般利用phi29 DNA聚合酶和六聚体随机引物对基因组进行扩增，在28~30 ℃条件下恒温即可反应。扩增时，六碱基随机引物在多个位点与模板DNA退火，在phi29 DNA聚合酶的作用下同时开始复制，其沿着模板合成DNA，同时取代模板的互补链。被置换的互补链又作为新的模板进行扩增，最终可获得大量的DNA。MDA和RCA技术的优点主要包括：①扩增高效性和高保真性；②产量稳定性；③扩增产物长度有保障；④应用方便、快捷。MDA/RCA最先被用于人类全基因扩增，此后广泛应用于真核细胞的研究，包括基因组测序和基因分型、肿瘤学研究和临床应用等，而且近年来，MDA/RCA技术在扩增经过预先处理的DNA (功能基因组学相关的DNA)方面的潜力也已被人们发觉。

但是MDA/RCA技术也存在一些问题，虽然具有高度的扩增效率和保真性，但用于单细胞扩增时仍存在缺陷，影响了其在研究和临床上的推广应用，主要包括以下几方面：①易产生扩增偏差；②易发生选择性扩增或等位基因脱扣现象，而等位基因选择性扩增（Preferential Amplification，PA）和等位基因脱扣（Allele Drop Out，ADO）是单细胞PCR过程常见的问题，也是引起误诊的关键；③常发生微卫星异常扩增或丢失；④易污染或非特异性扩增，由于MDA/RCA敏感性高，极少量的污染都会造成扩增失败。基于上述原因，现在MDA/RCA技术并没有大量普及使用。

发明内容

针对MDA/RCA技术存在的上述问题，本发明提供了一种针对微量、复杂DNA的高灵敏、高保真、高均一、高效率的扩增方法, 该扩增方法在微量、复杂DNA 库(谱)的扩增方面，扩增产物具有高忠实性、高特异性、高敏感性，并且能够保持不同序列的平衡扩增。

本发明第一个目的是提供一种海藻糖在微量、复杂DNA扩增中的应用。

本发明所述的海藻糖在全基因组DNA扩增中的应用，海藻糖以高浓度加入到扩增反应体系中，与DNA聚合酶（包括phi29 DNA聚合酶及由其改造而来的衍生DNA聚合酶或替代酶）作用，能够有效抑制非特异性扩增，使整合DNA库不同序列的DNA的扩增能够均一和平衡。

海藻糖在所述微量、复杂DNA扩增反应体系中的浓度优选为0.1mol/L~1mol/L。

本发明第二个目的是提供一种使用所述海藻糖进行微量、复杂DNA扩增的方法。加入含有海藻糖的DNA扩增反应体系、和DNA聚合酶（包括phi29 DNA聚合酶及由其改造而来的衍生DNA聚合酶或替代酶），27～42℃保温反应。