[发明专利]N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法

权利要求书

1.N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于它按以下步骤实现：

一、取5mL浓度为0.5～20mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加1.25～7.5mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A；

二、溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌10～40min，然后滴加2mL浓度为0.5～3.0mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，获得溶液B；

三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥24h，即得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒；

其中步骤一中新城疫L-系病毒液为经过去离子化处理的新城疫L-系病毒液，病毒含量为10^8.5EID₅₀。

2.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中取5mL浓度为1mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液。

3.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30min，然后滴加2mL浓度为1mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液。

4.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中N，O-羧甲基壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：

一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1～12h后加入60mL浓度为10～40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖；

二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，在搅拌状态下分5次加入到碱化壳聚糖中，每次间隔10min，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1％的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95％的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基壳聚糖的合成。

5.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中滴加的速度均为0.05mL/s。

6.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中滴加的速度均为0.05mL/s。