[发明专利]N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。 

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性、高度接触性、致死性禽类传染病，该病在雏鸡、火鸡、鸽、鹤、鹌鹑和鹦鹉等其它鸟类中能引起100％发病和死亡。该病的主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血，发病急、致死率高，是危害养禽业的最严重传染病之一。目前，该病的预防和控制的最重要和最有效的手段是接种疫苗。但是，现有疫苗的普遍缺点是免疫原性较弱，需用较强的免疫佐剂或合适的黏膜免疫传递系统才能有效诱导免疫应答。纳米疫苗是一种运用可降解生物材料和纳米技术改进现有疫苗的剂型和投递方式，从而保护抗原、简化接种程序、提高免疫效果的新型缓释疫苗，而且也解决了传统给药方式所带来的给药不便和药物浓度不稳定的问题，降低了药物的毒性，提高了药物的疗效。 

目前，疫苗黏膜免疫递送系统的研究日益得到广泛关注，然而，疫苗具有在体内降解和消除快、生物利用度低，体内半衰期短、需要佐剂和反复注射接种，副作用大、程序繁琐等缺点。另外，目前，大部分动物病毒病(如鸡新城疫、禽流感等)的灭活疫苗虽然能诱导产生高水平的血清循环抗体IgG，但不能诱导黏膜免疫应答，也就不能阻止病毒的感染。 

利用可生物降解高分子材料纳米粒对疫苗进行包裹，不仅可以保护疫苗完成投递过程，避免体内酸碱环境和酶类对抗原的破坏，而且能使抗原的释放方式、速度、部位等具有一定的选择性和可控性，利于实现疫苗的控制释放和靶向传输，为疫苗剂型和免疫途径的多样化提供了广阔的前景。同时，纳米粒还具有佐剂作用，能增强疫苗的抗原性，并优化免疫应答的类型，从而提高接种效率、增强免疫效果。但是，作为黏膜免疫的递送载体，需具备永久正电性和生理环境下的水溶性，因为这样可有效地降低跨上皮细胞电阻，打开上皮细胞的紧密连接，通过细胞旁路增加亲水性载药纳米粒子的转运，提高纳米粒的摄取率。 

壳聚糖作为自然界唯一带有阳离子的天然多糖，具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性以及抗菌等特殊功能，然而，壳聚糖只能溶于酸性溶液的性能缺陷使其在这一领域的应用受到了极大限制。因此，对壳聚糖进行化学改性，在壳聚糖分子上接入某些特殊基团改变其水溶性，可以极大扩展壳聚糖的应用范围。在更为理想的纳米载药粒子制备的设计中，寻求壳聚糖的水溶性途径已成为能否将其成功用作纳米载药粒子基质物质的关键。 

发明内容

本发明的目的是提供N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。 

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，按以下步骤实现： 

一、取5mL浓度为0.5～20mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加1.25～7.5mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A； 

二、溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌10～40min，然后滴加2mL浓度为0.5～3.0mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，获得溶液B； 

三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥24h，即得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒(简称为NDV-N-2-HACC/N，O-CMC-NPs)； 

其中步骤一中新城疫L-系病毒液为经过去离子化处理的新城疫L-系病毒液，病毒含量为10^8.5EID₅₀。 

本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒，粒径容易控制、粒径分布均匀(120～500nm)，Zeta电位为15～60mV，最大包封率可达98％，载药量大(65％～80％)。 

本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒，具有良好的相容性和生物黏附性，克服了传统注射疫苗造成的顺应性差、注射器和针头导致感染、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，药物毒副作用低，缓释时间长，生产成本较低、易于规模化生产。