[发明专利]一种包括酵母细胞中表达的HPV16型L1和E7靶抗原的嵌合蛋白疫苗及其制备方法

权利要求书

1.制备包含由在酵母中表达的人乳头瘤病毒16型病毒的重组蛋白L1E7的疫苗的方法，其包括设计引物克隆HPV16LI/E7基因及构建真核表达质粒；将构建成功的真核表达质粒转化酵母菌株，筛选稳定高效分泌表达菌株；发酵并诱导表达目的蛋白；纯化目的蛋白；将纯化的重组蛋白制成疫苗的步骤，其特征在于，在甲醇浓度为1.0％，pH为6.0条件下诱导酵母菌株表达重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于克隆HPV16LI/E7基因的引物为：

LI上游5’CC TACGTA CATCATCATCATCATCAT CAGGTGACTTTTATT3’；

LI下游5’CCC AAGCTT CAGCTIACGTTTTTTGCGTTTAGC3’；

E7上游5’CCCAAGCTT ATGCATGGAG ATACACCTAC3’

E7下游5’ATAAGAAT GCGGCCGC TTATGGTTTCTGAGAACAGATG3’。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中的真核表达质粒是pPIC9k-L1/E7。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中的酵母菌株是毕赤酵母菌株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于酵母菌为毕赤酵母组氨酸缺陷型GS115菌株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于真核表达质粒转化酵母菌株的方法是电转化。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在pH＝6.0、温度28～30℃振摇培养毕赤酵母组氨酸缺陷型GS115菌株48h，然后每隔24h添加终浓度为1％的甲醇诱导重组蛋白表达，96h后收样。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，收样后，对样品进行离心，用玻璃珠破碎细胞沉淀，然后14000r/min离心2min，收集上清，接着从上清液中纯化目的蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将纯化的重组蛋白制成疫苗包括向纯化的重组蛋白中加入终浓度约为1mg/ml的佐剂氢氧化铝，充分混合，于4℃保存。

10.权利要求9的方法制备得到的疫苗在制备用于预防和治疗由HPV16引起的感染和疾病的药物中的应用，其中所述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。