[发明专利]一种基因消除PCR的方法

权利要求书

1.一种基因消除PCR的方法，其步骤是：

(1)基因消除PCR模板的制备：

a.限制性核酸内切酶ApeK-I和Mse-I消化含目标基因的混合基因群体；

b.设计并合成四条寡核苷酸链O1，O2，O3，O4并制备接头，与上述(1)中a步骤的限制性酶切片段连接；

c.Oligo-dT柱子纯化上述(1)中b步骤加上接头的片段作基因消除PCR模板；

(2)基因消除PCR引物的制备：

a.限制性核酸内切酶ApeK-I和Mse-I消化不含目标基因的混合基因群体；

b.设计并合成四条寡核苷酸链O5，O6，O7，O8并制备接头，与上述(2)中a步骤的限制性酶切片段连接；

c.根据限制性内切酶位点与接头序列设计引物O5和O7对上述(2)中b步骤加上接头的片段进行PCR扩增；

d.采用乙醇沉淀法对(2)中c步骤PCR产物进行纯化；

e.限制性核酸内切酶Mse-I消化(2)中d步骤纯化的PCR产物；

f.PCR产物清洁试剂盒纯化上述(2)中e步骤酶切产物作基因消除PCR引物；

(3)基因消除PCR循环：

a.消除非目标基因，富集目标基因，条件为：在94℃条件下预热1分钟30秒；12至15个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，60℃退火40秒，75℃延伸8分钟，20ul反应体系为：40ng基因消除PCR模板，45ng基因消除PCR引物，6pM PCR引物O1，4mM dNTP，4ul 5×Phusion HF Buffer，4U ApeK-I，0.35UPhusion DNA Ploymerase；

b.目标基因的进一步扩增，条件为：在94℃条件下预热1分钟30秒；25至30个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，54℃退火40秒，72℃延伸2分钟30秒，20ul反应体系为：4ul目标基因富集PCR产物，2ul 10×PCR Buffer，4mM dNTP，8pM PCR引物O1，8pM PCR引物O3，0.5U TaKaRa Taq，经过循环之后目标基因在琼脂糖凝胶上检测出来。

2.根据权利要求1所述的一种基因消除PCR的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的限制性核酸内切酶的识别位点如下：

ApeK-I：5’-GCWGC-3’

3’-CGWC▲G-5’

Mse-I：5’-TTAA-3’

3’-AAT▲T-5’

ApeK-I为耐高温的限制性内切酶。

3.根据权利要求1所述的一种基因消除PCR的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中设计的寡核苷酸链序列如下：

O1：5’-TTACCACGACCACCCTATTGCTGCTGC-3’

O2：5’-TAGCAGAAGCAATAGGGTGGTCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’

O3：5’-ACGAGGTGCGGTCTTGGACTACTT-3’

O4：5’-CWGAAGTAGTCCAAGACCGCACCTCGT-3’

O2中设计有36个A的Poly(dA)，用于mRNA纯化柱的纯化。

4.根据权利要求1所述的一种基因消除PCR的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中制备接头的方法：按合成报告单上说明将合成的寡核苷酸溶于去离子水中，在微量离心管中分别将O1和O2，O3和O4按60ul反应体系混合，60ul反应体系为：15ul O1，15ul O2，24ul ddH₂O，6ul 10×PCR Buffer；15ul O7，15ul O8，24ul ddH₂O，6ul 10×PCR Buffer，在PCR仪中95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成的接头：O1/O2，O3/O4如下：

接头O1/O2中，设计有含一个碱基误配的ApeK-I酶切位点。

5.根据权利要求1所述的一种基因消除PCR的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中连接酶为T4 DNALigase，50ul反应体系：接头与酶切片段的摩尔数之比约为10∶1，5ul 10×T4 Ligase Buffer，1Weiss U T4Ligase，加离子水至50ul。