[发明专利]一种基因消除PCR的方法

说明书

技术领域

本发明属分子生物学领域，涉及一种基因消除PCR的方法，具体涉及一种通过PCR的方法将基因群体中的非目标基因消除从而达到分离目标基因的目的，主要应用于生物学，医学，农学，畜牧兽医学，环境科学，食品科学等与分子生物学相关的基因消除和基因分离技术领域。

背景技术

PCR，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些特点，实现在体外对某些特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。

PCR技术的原理是：DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起始点，沿模板5’-3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR反应中，通过双链DNA的高温变性(denaturation)、引物与模板的低温退火(annealing)和适温延伸(extension)这三步反应反复循环。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，从而达到迅速大量扩增的目的。

PCR技术操作简便、结果可靠，并被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了革命性的影响。然而我们使用PCR的目的是用来扩增已知或部分已知基因片段，对于那些我们未知的新基因，由于缺少相关信息，我们就无法有效地对其扩增。

[0003]抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)是Diatchenko等于1996年依据消减杂交和抑制PCR发展起来的一种分离差异表达基因的新方法。

该方法主要基于抑制PCR，并结合标准化(normalization)和消减杂交(subtractive hybridization)技术。所谓抑制PCR就是通过利用含引物序列的双链接头(adaptor)充当引物模板，使两端接上同一接头的非目的双链片段(具有反向末端重复序列)，在退火时产生“锅-柄”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列的扩增，以达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。该方法运用了杂交二级动力学原理，即高丰度单链cDNA在退火时同源杂交速度快于低丰度单链cDNA，标准化步骤平衡了目的基因群中cDNA的丰度，从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致，即低丰度差异表达的基因不会丢失，而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交则扣除了目的基因群(tester)与驱赶基因群(driver)间的同源序列。SSH技术的操作流程：首先提取2种细胞或组织的mRNA，并反转录获得cDNA，用含有4个碱基的限制性核酸内切酶(RsaI或HaeIII)酶切，产生大小适当的平端cDNA片段，将tester cDNA分为均等的2份，各自连接接头，将过量的driver cDNA分别加到2份tester cDNA中，变性后退火杂交，获得4种杂交产物：单链tester cDNA、双链tester cDNA、异源双链cDNA和双链driver cDNA。第一次杂交使单链tester cDNA均等化并富集差异表达基因，  然后合并2份杂交产物，另加上新的变性单链drivercDNA，再次退火杂交；第二次杂交中只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链tester cDNA，它能与driver cDNA一起形成各种双链分子，并产生新的双链分子，这种分子的2个5’端有2个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效扩增。2次杂交后，填平黏性末端，利用巢氏PCR原理进行扩增。