[发明专利]大流行流感病毒裂解疫苗

权利要求书

1.一种大流行流感病毒裂解疫苗的制备方法，其包括NIBRG-14病毒的接种培养、灭活病毒、病毒液澄清和浓缩、层析纯化病毒、Triton X-100裂解病毒、超滤膜二次纯化、除菌过滤、氢氧化铝吸附、分装冻干制成疫苗成品的步骤，其特征在于：其中采用毒性弱且可自行分解的烷化剂二乙烯亚胺和辅料甲醛组合形成灭活剂对病毒进行灭活。

2.根据权利要求1所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：二乙烯亚胺和辅料甲醛终浓度为1比4000，在20-25℃作用6小时灭活病毒。

3.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：NIBRG-14病毒的接种培养按照如下步骤进行，将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10-5稀释度，尿囊腔接种10日龄健康SPF鸡胚，病毒接种量为0.2ml/枚，将接种病毒的鸡胚放在37.5℃，相对湿度60％下培养，于接种病毒后56小时取鸡胚放置于4℃冷胚18小时后，收获病毒尿囊液。

4.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于∶病毒液澄清和浓缩包括滤网过滤、滤膜过滤，超滤和衡滤浓缩。

5.根据权利要求4所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：病毒液澄清和浓缩具体步骤如下：将各批单型别的病毒原液分别用盖有120目滤网合并过滤，添加柠檬酸钠和EDTA去除尿囊液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测pH值达到7.8后再添加0.5mol/L的磷酸盐溶液PB，取样检测使pH值达7.2±0.2，将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤，即经10um滤膜粗滤后，再经两次0.45um滤膜过滤，最后用相对分子质量1000KD的膜进行超滤浓缩，0.01M pH 7.2的PBS进行8倍体积的衡滤作最后浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/L的PB回收病毒液。

6.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：病毒纯化采用分子筛凝胶层析系统。

7.根据权利要求6所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：分子筛凝胶层析系统为Amersham的BPG200.750；凝胶为Sepharose 4FF，凝胶过滤介质是4％琼脂糖的高度交联体，层析柱凝胶装量为14L，使用的平衡盐溶液为0.01M pH 7.2的PBS，流速为150ml/min，样品上样量为700ml。

8.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：Triton X-100裂解是用0.01M pH7.2的PBS将裂解剂Triton X-100稀释至浓度为0.5％，与大流行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合，于室温20-25℃作用2小时。

9.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：超滤膜再纯化选用截留分子量为100kD的超滤膜，超滤缓冲液用0.01mol/L的PBS(pH＝7.2)，进液压力在50psi左右，回流压力为0-10psi，采用PBS超滤10倍体积，用于Triton X-100去除工艺。

10.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法制备得到的疫苗，其内毒素含量为低于70EU/ml。