[发明专利]一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法

权利要求书

1.一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法，其特征在于：包括如下步骤，

(1)配制非变性聚丙烯酰凝胶；

(2)将收集的菌体或细胞湿重0.5g用PBS缓冲液5ml重悬，置离心机中，离心速度2000rpm，4℃下离心5min后，弃去上清液；

(3)向5ml PBS缓冲液中加入蛋白酶抑制剂5μl，混匀后加入到上述的菌体或细胞收集管内，-80℃～30℃反复冻融3次～5次，每次融化后，15000rpm离心5min后重悬，最后一次离心直取上清液，冷冻；

(4)上述细胞冻融液为蛋白初提液，取100μl蛋白液，与100μl的2×溴酚蓝上样Buf混合后，点样电泳，每个点样孔20μl，共10个孔；

(5)电泳：4℃80V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶后；改换130V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程115～120min；

(6)剥胶：将胶片剥落后，切取两个泳道用于考马斯亮蓝染色，即胶条用考马斯亮蓝染色浸泡，摇床上过夜染色，摇床转速130～150rpm；

(7)剩下的胶片进行活性染色：取一次性塑料染色盘，将胶片剥落入盘，然后用纯水清洗一次，弃去废液后，用矿物油封住胶面，用10ml一次性注射器从配好的染色液管中吸取下层的紫黑色染色液，每次吸取7.5ml，共吸取2次，注入染色盘矿物油下，与胶接触，使用量为刚刚没过胶面，吸取0.02g/ml的NaNO₂5ml注入染色盘底部，与染色液混合，轻轻摇晃振荡，暗处放置10～15min，将染色盘放置在凝胶读片灯下，观察到是否都已经染色均匀，凝胶取出后，置于纯水中，加入30％H₂O₂5～10μl放置在摇床上，轻轻摇动脱色2～5分钟，直至蓝紫色条带出现，立即取出拍照，割胶回收；

(8)透析法小量纯化得到烯醇化酶，将割下的胶条用纯水冲洗两次，然后放入透析袋中，透析袋中装入2ml的1X电泳缓冲液，放入水平电泳槽内，让电泳槽内的电泳液面高于小透析袋内的胶条，70V恒压电泳15min；

(9)将透析袋内的胶条弃去，袋内液体回收至3KD的4ml的超滤管内，5000rpm离心10分钟，超滤管截流下的液体为浓缩后的烯醇化酶纯化产物。

2.按权利要求1所述的一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法，其特征在于：所述的配制非变性聚丙烯酰凝胶，用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，用HCl调节pH值至7.4，加水至1升，高压蒸汽灭菌后使用。