[发明专利]一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法。

背景技术

烯醇化酶(enolase)，又称2-磷酸甘油水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化磷酸甘油酸盐向磷酸烯醇式丙酮酸转变，同时也在糖异生过程中催化逆向反应。通常对该酶蛋白活性进行测定的方法是采用体外模拟部分糖代谢反应链。过程为烯醇化酶催化2-磷酸甘油酸形成PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)，PEP脱去磷酸根成为丙酮酸，在乳酸脱氢酶作用下成为乳酸，并使NADH⁺(还原型辅酶I)转化为NAD(氧化型辅酶I)和H⁺。用波长340nm的分光光度计测定反应过程中单位时间内NADH转变为NAD的量，从而确定烯醇化酶活性。这个方法是现在所常用的方法，而对于研究新的细菌内烯醇化酶的特点，该方法只能定量检测，而无法直观化。对于直观化的鉴定方式，往往是基因工程表达相应的酶蛋白，依赖抗体的制备，运用Western Blotting、ELISA等方法鉴定，实验周期长，价格非常昂贵，不经济实用。

发明内容

本发明的目的是设计一种鉴定及纯化细胞内烯醇化酶的方法，能直观化地鉴定及纯化细胞内烯醇化酶，该方法操作简便，实验周期短，价格低廉，经济实用。

为此，本发明的包括下步骤：

(1)配制非变性聚丙烯酰凝胶；

(2)将收集的菌体或细胞湿重0.5g用PBS缓冲液5ml重悬，置离心机中，离心速度2000rpm，4℃下离心5min后，弃去上清液；

(3)向5ml PBS缓冲液中加入蛋白酶抑制剂5μl，混匀后加入到上述的菌体或细胞收集管内，-80℃～30℃反复冻融3次～5次，每次融化后，15000rpm离心5min后重悬，最后一次离心直取上清液，冷冻；

(4)上述细胞冻融液为蛋白初提液，取100μl蛋白液，与100μl的2×溴酚蓝上样Buf混合后，点样电泳，每个点样孔20μl，共10个孔；

(5)电泳：4℃80V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶后；改换130V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程115～120min；

(6)剥胶：将胶片剥落后，切取两个泳道用于考马斯亮蓝染色，即胶条用考马斯亮蓝染色浸泡，摇床上过夜染色，摇床转速130～150rpm；

(7)剩下的胶片进行活性染色：取一次性塑料染色盘，将胶片剥落入盘，然后用纯水清洗一次，弃去废液后，用矿物油封住胶面，用10ml一次性注射器从配好的染色液管中吸取下层的紫黑色染色液r，每次吸取7.5ml，共吸取2次，注入染色盘矿物油下，与胶接触，使用量为刚刚没过胶面，吸取0.02g/ml的NaNO₂5ml注入染色盘底部，与染色液混合，轻轻摇晃振荡，暗处放置10～15min，将染色盘放置在凝胶读片灯下，观察到是否都已经染色均匀，凝胶取出后，置于纯水中，加入30％H₂O₂5～10μl放置在摇床上，轻轻摇动脱色2～5分钟，直至蓝紫色条带出现，立即取出拍照，割胶回收；

(8)透析法小量纯化得到烯醇化酶，将割下的胶条用纯水冲洗两次，然后放入透析袋中，透析袋中装入2ml的1X电泳缓冲液，放入水平电泳槽内，让电泳槽内的电泳液面高于小透析袋内的胶条，70V恒压电泳15min；

(9)将透析袋内的胶条弃去，袋内液体回收至3KD的4ml的超滤管内，5000rpm离心10分钟，超滤管截流下的液体为浓缩后的烯醇化酶纯化产物。

所述的配制非变性聚丙烯酰凝胶，用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2gKCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，用HCl调节pH值至7.4，加水至1升，高压蒸汽灭菌后使用。上述方法实现了本发明的目的。

本发明的优点是能直观化地鉴定及纯化细胞内烯醇化酶，该方法操作简便，实验周期短，价格低廉，经济实用。

具体实施方式