[发明专利]一种拟穴青蟹ETFB基因及其克隆、检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及蟹类主要代谢器官中表达的基因序列，更具体涉及一种拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB的核苷酸序列、氨基酸序列及其克隆方法、检测方法和应用。

背景技术

黄素蛋白是一类以黄素核苷酸作为辅酶或辅基、参与线粒体呼吸链的组成，通过辅酶或辅基可接受和提供两个质子和两个电子，起到氧化还原酶或电子传递体的作用。电子转移黄素蛋白（Electron Transfer Flavoprotein，ETF）是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）为辅酶的蛋白质。目前ETF已经成功地从哺乳动物如人、鼠和猪中，以及一些细菌中如脱氮副球菌、埃氏巨球形菌和食甲基嗜甲基菌中鉴定出来。在这些生物中，ETF是由30KDa的α亚基和28KDa的β亚基构成异源二聚体，每个亚基包含一个黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）和一个腺苷一磷酸（Adenosine Monophosphate，AMP）。ETF是线粒体和细菌异化途径及呼吸链中至少11种脱氢酶的重要电子传递体，典型途径为通过ETF-泛醌氧化还原酶将电子从最初的脱氢酶转移至泛醌，以保证电子传递链持续运转产生质子势能。

蟹类生长所需的能量代谢受多种内外因素的调节，归根结底，它是受到相关基因的控制调节。在有关哺乳类研究中表明：ETF为核基因组编码，在细胞质内合成后再转移至线粒体加工处理为成熟肽，通过ETF-泛醌氧化还原酶将电子转移至泛醌，使得多种一级脱氢酶和泛醌-细胞色素C发生联系，从而保证电子传递链的运转生成生命活动的所需能量。在细菌中的研究也发现类似的机制。在蟹类中，目前还没有鉴定出电子传递黄素蛋白基因，如能找到呼吸链中联系电子转移和脱氢酶中的基因，则可以通过多种研究手段，如RNA干扰（RNAi），基因过表达，启动子分析，真核表达与具生物活性蛋白质分离纯化，体外生化功能分析，从而为阐明蟹类ETFB基因在电子传递机制和能量代谢的功能及其发生机制奠定理论基础。

发明内容

本发明旨在提供一种通过5’-RACE和3’-RACE技术克隆得到拟穴青蟹ETFB基因，还提供了所述ETFB基因的克隆方法、检测方法和应用。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

一种拟穴青蟹ETFB基因，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。

一种拟穴青蟹ETFB基因，它编码的蛋白质具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明所述的拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因（即拟穴青蟹ETFB基因）是从拟穴青蟹的肝胰脏中鉴定出的一种电子转移黄素蛋白β亚基基因。所述的电子转移黄素蛋白β亚基基因是通过5’-RACE和3’-RACE技术克隆得到的一个基因，其cDNA核苷酸序列和编码的蛋白质序列如下。该基因cDNA全长1030bp，自18bp到782bp区段为其开放阅读框，编码254个氨基酸，5’端非编码区长17bp，3’端非编码区长248bp，包含1个mRNA半衰调节基序（ATTTA），多聚腺苷酸加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中进行Blast同源性测定，确定该cDNA编码电子转移黄素蛋白β亚基基因。

拟穴青蟹电子转移黄素蛋白β亚基基因ETFB核苷酸序列如下（SEQ ID NO.1）：