[发明专利]一种基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微流控芯片的电泳分析技术领域，具体地涉及一种利用微流控芯片电泳-激光诱导荧光联用技术分离检测益生菌的种类。

背景技术

益生菌是指对人体和动物有益的细菌，能够通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，以提高宿主健康水平。益生菌制品已经在人们的日常生活中扮演着重要角色。因此，检测益生菌制品中益生菌的种类以确保其制品的质量尤为重要。细菌的检测技术有血清法、流式细胞术、蛋白质分析、组成分析、特征分析等，以上分析技术因分析时间长而无形中增加了工作量。另外，由于细菌具有组成复杂、相似性高的特点降低了分析结果的可靠性。

本发明克服了现有技术中细菌检测技术的分析时间长、工作量大、分析结果可靠性有限等缺陷，提出了一种基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，利用微流控芯片电泳-激光诱导荧光联用技术分离检测益生菌的种类。本发明检测方法具有操作步骤简单易行，分析时间短，样品用量少，灵敏度高，分析结果准确等优点，适用于进行益生菌制品中的益生菌检测。

发明内容

本发明提出了一种基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，包括以下步骤：

第一步 制备运行缓冲液

将Tris、硼酸、EDTA溶于去离子水中得到TBE储备液，加入聚环氧乙烷得到TBE-PEO储备液，经所述TBE储备液稀释并调节pH后得到运行缓冲液，于4℃温度下储存备用；

第二步 制备细菌悬浮液

将益生菌悬浮于第一步制备得到的所述运行缓冲液中，经离心去除上清液，再悬浮于所述运行缓冲液中得到细菌悬浮液；

第三步 衍生步骤

将第二步制备得到的所述细菌悬浮液与荧光染料混合，于黑暗处衍生，经离心去除上清液；

第四步 微流控芯片及其微通道的预处理

依次采用氢氧化钠溶液、去离子水、运行缓冲液对微流控芯片进行冲洗；

第五步 电泳检测步骤

采用经第四步处理的微流控芯片经过电泳进样、分离、激光诱导荧光检测，对经第三步处理的细菌悬浮液中益生菌的种类进行检测。

其中，所述第一步中的TBE储备液中，Tris浓度为4.0mmol/L, 硼酸浓度为4.0mmol/L、EDTA浓度为0.09mmol/L；所述TBE-PEO储备液中聚环氧乙烷的质量分数为0.5%。

其中，所述第一步中，调节pH为8.5。

其中，所述第三步中的荧光染料为SYTO 62。

其中，所述第四步中的氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L。

其中，所述第五步中，电泳进样时的电压设置为第一液槽1300V，第二液槽650V，第三液槽0V，第四液槽1000V，持续15s；电泳分离时的电压设置为第一液槽1300V，第二液槽2150V，第三液槽1300V，第四液槽0V，持续200s。

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是推出一种基于微流控芯片电泳-激光诱导荧光联用分离检测益生菌种类的方法。该方法具有快速准确可靠等优点。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一步 制备运行缓冲液

将一定量的Tris、硼酸、EDTA溶于去离子水中，得到浓度分别为Tris4.0 mmol/L，硼酸4.0 mmol/L 和EDTA0.09 mmol/L的TBE储备液。称取0.2 g聚环氧乙烷（PEO）溶于40 ml TBE中得到含PEO 0.5% 的TBE-PEO储备液。将TBE-PEO储备液用TBE储备液稀释并调其pH值后得到运行缓冲液，保存于4℃冰箱中。正式实验前用0.2μm 滤纸对运行缓冲液进行过滤。

第二步 制备细菌悬浮液

分别取培养22 h的双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和粪肠球菌，3400rpm离心3 min，去掉培养基后悬浮于运行缓冲液中，再经3400 rpm 离心3 min去掉上清液，最后悬浮于运行缓冲液中配成浓度为1.0×10⁷ CUF的细菌悬浮液。使用前用漩涡仪漩涡数秒，使悬浮液中细菌重悬。

第三步 衍生步骤

选用激发波长为635的荧光染料，此染料可以透过细胞膜标记核酸（DNA和RNA）。细菌悬浮液的浓度为1.0×10⁷ CUF，取1.5 mL该悬浮液与3.0 μl 5 mmol/L的荧光染料混合后于黑暗条件下衍生30 min后，经3400 rpm离心3 min，去掉上清液。

第四步 微流控芯片及其微通道的预处理