[发明专利]乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用

权利要求书

1.一种乙型肝炎病毒突变体，包括乙肝病毒基因组，所述乙型肝炎病毒突变体的突变发生在乙型肝炎病毒基因组序列第216位和/或第285位，所述第216位发生的突变为碱基T突变为C，所述第285位发生的突变为碱基G突变为A。

2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变体，其特征在于，所述乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。

3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变体，其特征在于，所述乙型肝炎病毒突变体编码的S蛋白与正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位发生突变，第21位氨基酸的突变是由亮氨酸突变为丝氨酸，第44位氨基酸的突变是由甘氨酸突变为谷氨酸。

4.如权利要求3所述的乙型肝炎病毒突变体，其特征在于，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：12。

5.一种扩增乙肝病毒基因组序列第216位和285位基因片段的HBV突变扩增试剂盒，包括引物、dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH₂O，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述引物特异性扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段。

6.如权利要求5所述的HBV突变扩增试剂盒，其特征在于，所述引物序列为SEQ ID NO：8～9。

7.如权利要求5所述的HBV突变扩增试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。

8.如权利要求7所述的HBV突变扩增试剂盒，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶为PrimeStar。

9.如权利要求5所述的HBV突变扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲溶液为5×PrimeStar buffer。

10.如权利要求5-9任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：预变性94℃3min，然后94℃30s，57℃15s，72℃2min 45个循环，72℃延伸10min。

11.权利要求5-10任一权利要求所述的试剂盒的使用方法，步骤如下：

1)DNA模板的制备：抽取外周静脉血并提取HBV基因组作为DNA模板；

2)PCR扩增：通过权利要求5-10任一权利要求所述HBV突变扩增试剂盒，对步骤1)制备的DNA模板经扩增程序进行PCR扩增反应；

3)纯化PCR产物。

12.如权利要求11所述的使用方法，其特征在于，所述扩增程序为：预变性94℃3min，然后94℃30s，57℃15s，72℃2min 45个循环，72℃延伸10min。

13.如权利要求1-4任一权利要求所述的乙型肝炎病毒突变体或权利要求5-10任一权利要求所述的HBV突变扩增试剂盒在制备重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防试剂中的应用。

14.一种重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防的方法，为检测对象血液中是否含有权利要求1-4任一权利要求所述的乙型肝炎病毒突变体。

15.如权利要求14所述重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防的方法，所述检测对象血液中是否含有所述乙型肝炎病毒突变体的步骤如下：

1)DNA模板的制备：抽取检验对象外周静脉血并提取HBV基因组作为DNA模板；

2)PCR扩增：将步骤1)制备的DNA模板加入到PCR反应体系中，扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段；

3)纯化PCR产物；

4)PCR产物测序：将步骤3)纯化获得的PCR产物通过基因测序技术进行测序；

5)结果分析：将步骤4)的测序结果与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的序列进行比对，确认PCR产物对应的乙肝病毒基因组序列第216位和/或285位是否存在突变。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的PCR反应体系包括引物、dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH₂O；所述引物包括上游引物和下游引物。