[发明专利]乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及乙型肝炎病毒的新突变、突变扩增试剂盒及应用。

背景技术

目前全球估计有3.5亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者，有三分之一的人口感染过HBV。在我国，乙型肝炎是最为严重、最广泛的传染病之一，感染率高达60％，约有1.2亿人携带HBV。乙型肝炎的发病率居传染病首位，死亡数居传染病第三位。

根据临床表现的不同HBV感染可分为多种类型：无症状携带状态，急性自限性肝炎，慢性肝炎，暴发型肝炎(fulminant hepatitits，FH)。母婴传播是HBV的重要传播途径，患者通常处于免疫耐受状态的，对HBV不发生应答，但是往往绝大部分无症状携带者会发生肝炎，甚至有一部分最终发展为FH。乙型肝炎重症化的机制一直未明确，目前认为是由宿主免疫和病毒两方面的作用所致。关于HBV变异和重肝的发生仍存在争议，尚没有一个基因变异可以作为重型乙型肝炎的标志性变异。而且大量的研究表明HBV在病人体内时以准种形式存在的，要研究病毒突变与肝炎的关系，必须考虑到HBV的准种特性。目前大多数研究采用的PCR-克隆-测序的方法研究HBV准种。因此，找到与肝炎加重密切相关的基因位点，将会为HBV的临床早期诊断和干预提供帮助。

发明内容

本发明的目的在于提供与肝炎加重密切相关的乙肝病毒突变体，突变扩增试剂盒，及应用，为HBV的临床早期诊断和干预提供帮助。

本发明一方面公开了一种乙型肝炎病毒(简称乙肝病毒或HBV)突变体，包括乙肝病毒基因组，所述乙型肝炎病毒突变体的突变发生在乙型肝炎病毒基因组序列第216位和/或第285位，所述第216位发生的突变为碱基T突变为C(216T→C)，所述第285位发生的突变为碱基G突变为A(285G→A)。

较优的，所述乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。

进一步的，所述乙肝病毒突变体HBV基因组序列的互补序列上，与基因组第216位对应位点的突变为A突变为G，与基因组第285位对应位点的突变为C突变为T。

较优的，所述乙型肝炎病毒突变体编码的S蛋白与正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位发生突变，第21位氨基酸的突变是由亮氨酸(L)突变为丝氨酸(S)，第44位氨基酸的突变是由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)。

更优的，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：12。

MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLR

RFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSW

AFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI(SEQ IDNO：12)

本发明第二方面公开了一种扩增乙肝病毒基因组序列第216位和285位基因片段的HBV突变扩增试剂盒，包括引物、dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH₂O，所述引物包括上游引物和下游引物，所述引物特异性扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段。

较优的，所述DAN聚合酶为高保真DNA聚合酶；更优的，所述高保真DNA聚合酶为Prime Star。

较优的，PCR缓冲溶液为5×Prime Star buffer。

较优的，所述上游引物和下游引物序列如下：

本发明试剂盒PCR体系如下：

加ddH₂O定容至总体积50μL。

较优的，本发明的试剂盒还可以包括DNA提取试剂。

较优的，本发明的HBV突变扩增试剂盒的扩增程序为：预变性94℃3min，然后94℃30s，57℃15s，72℃2min 45个循环，72℃延伸10min。

本发明第三方面公开了一种HBV突变扩增试剂盒的使用方法，步骤如下：