[发明专利]利用代谢组学改进微藻培养条件以提高产油能力的方法

权利要求书

1.利用代谢组学改进微藻培养条件以提高微藻产油能力的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)对微藻胞内的代谢物进行测定：

①细胞收集及淬灭：

对微藻进行培养，在培养过程的指数中期、后期和稳定期三个时间的至少一个时间点取出藻液样品100-150mL，每个时间点取出3-5份，4℃下3000-5000rpm，离心3-4min，收集下层的细胞，用3-5mL代谢终止液在-40℃下淬灭5-10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；

所述代谢终止液为含有1500mg·L^-1NaNO₃，36mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，75mg·L^-1MgSO₄·7H₂O和40mg·L^-1K₂HPO₄·3H₂O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；

②提取细胞内代谢物：

取步骤①获得的冻干细胞15-25mg分别置于离心管中，每管加入1-2mL-40℃的代谢提取液，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融3-5次，在-20℃下4000-6000rpm离心1-2min，收集上清，另向残渣中加入0.5-1mL代谢提取液，-20℃下4000-6000rpm离心1-2min，离心后，两次上清液混合，加入10-20μg氘标记琥珀酸，得混合液，取200μL混合液，在-80℃下冷冻干燥2-4小时；

所述代谢提取液为体积百分含量为50％的甲醇水溶液；

③代谢物衍生化

向步骤②获得的样品中加入20mg·mL^-1的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反应60-80min，反应结束后加入80μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反应60-80min，8000-12000rpm离心1min，取上清100μL放入已编号的GC进样瓶，室温放置2h；

④GC-MS检测

采用GC-MS对步骤③所得样品进行定性和定量处理，条件如下：

色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；

进样量：1μL；

分流比：10∶1；

进样口温度：280℃；

GC interface温度：270℃；

氦气流速：恒压，91KPa；

升温程序：70℃保持2min，以5℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；

电离电压：70eV；

源温：250℃；

扫描范围：50-800m/z；

扫描速度：2scan·s^-1；

从而获得了微藻的代谢物定性和定量数据；

(2)对微藻的产油能力进行分析：

①细胞收集及淬灭：

对微藻进行培养，在培养过程的指数中期、后期和稳定期三个时间的至少一个时间点取出藻液样品100-150mL，每个时间点取出3-5份，4℃下3000-5000rpm，离心3-4min，收集下层的细胞，用3-5mL代谢终止液在-40℃下淬灭5-10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；

所述代谢终止液为含有1500mg·L^-1NaNO₃，36mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，75mg·L^-1MgSO₄·7H₂O和40mg·L^-1K₂HPO₄·3H₂O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；

②提取细胞内脂肪酸：

取步骤①获得的冻干细胞15-25mg分别置于离心管中，每管加入0.75-1.5mL氯仿及0.3-0.6mL超纯水，100rpm震荡1h；再加入2-4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；向残渣中加入2-4mL脂肪提取液，室温下以100rpm震荡0.5h，收集氯仿相；反复提取3次，将氯仿相合并，加入0.5-1mL 1M KCl水溶液，震荡，3000-4000rpm，离心3-5min，弃水相，再加入1-2mL超纯水，震荡，3000-4000rpm，离心3-5min，弃水相，30-35℃真空干燥得干物质；

所述脂肪提取液为体积百分含量为66.7％的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液含有质量百分比为0.1％的二丁基羟基甲苯；

③脂肪酸甲酯化：

将所述干物质溶于600-1000μL质量百分比为14％的三氟化硼-甲醇溶液中，加入10-20μg十七烷酸做为内标，置于15mL密封管内，在100℃水浴20-30min，温度降至室温，加入500-1000μl正己烷震荡萃取30s，4000-5000rpm离心2min，得到正己烷相；取100-200μL正己烷相放入已编号的GC进样瓶；

④GC-MS检测

采用GC-MS对正己烷相中的脂肪酸甲酯进行定性和定量处理，条件如下：

色谱柱：DB-5气相色谱柱，其规格为30m*0.25mm，0.25μm；

进样量：1μL；

分流比：10∶1；

进样口温度：280℃；

GC interface温度：270℃；

氦气流速：恒压，91KPa；

升温程序：70℃保持2min，以8℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；

电离电压：70eV；

源温：250℃；

扫描范围：50-800m/z；

扫描速度：2scan·s^-1；

从而获得了脂肪酸甲酯混合物中的单个脂肪酸甲酯的含量；

⑤日产量

根据如下公式计算微藻脂肪酸甲酯混合物的日产量：

P＝∑Wi/Day/CV

其中P是微藻脂肪酸甲酯日产量，Wi是步骤④中所得样品中每个脂肪酸甲酯的重量，Day是步骤①所述从微藻接种到微藻收获的时间长度，CV是步骤①所述收获时微藻培养液的体积；

⑥十六烷值确定

根据如下公式计算微藻脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：

SN＝∑(560×Pi)/MWi             a

IN∑(254×D×Pi)/MWi            b

CN＝46.3+5458/SN-0.225×IN      c

其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步骤④中所得样品中每个脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步骤④中所得样品中每个脂肪酸甲酯的分子量，D是步骤④中所得样品中每个脂肪酸甲酯的双键数量。

(3)PLS分析

将步骤(1)获得的微藻代谢物含量为自变量，将步骤(2)获得的微藻脂肪酸甲酯日产量和十六烷值为因变量，使用PLS分析，得到与产油相关的代谢标志物；

(4)过程分析

将步骤(3)获得的代谢物标志物的含量按照培养条件差异制成图表，观察并分析这些代谢物变化的规律，进而发现在微藻产油过程中起关键作用的代谢物及相关代谢网络，从而为以提高微藻脂肪酸甲酯产量和质量为目的的微藻培养条件提供优化方向。

2.根据权利要求1所述的利用代谢组学改进微藻培养条件以提高微藻产油能力的方法，其特征是所述微藻为小球藻(Chlorella sorokiniana)、栅藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)及鱼腥藻(Anabaena sp.PCC7120)。