[发明专利]利用代谢组学改进微藻培养条件以提高产油能力的方法

说明书

发明领域

本发明属于生物燃料领域，涉及一种利用代谢组学改进微藻培养条件以提高产油能力的方法。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭和人们对环境保护问题的不断重视，开发可持续发展的绿色新能源被提上日程并吸引了越来越多的关注。最早的生物能源来源于粮食作物，但是由于与粮争地，引起了严重的粮食危机，现逐渐被第二代生物能源取代。第二代生物能源主要是通过来自于秸秆等废弃的纤维素资源生产的乙醇，纤维素来源广泛而丰富，但是前处理过程产生大量的毒性抑制物质是一个大的限制因素。而且与汽油或柴油相比，乙醇具有更高的腐蚀性，效力也较低。最后，乙醇的使用需要与现有发动装置完全不同的另一套配送基础结构及引擎，适配性较差，其应用受到了较大的技术限制。因而从富油生物质中提取脂肪酸甲酯混合物，即生物柴油为生物燃料的发展提供了更吸引的前景。

而且十六烷值是国际上公认的生物柴油质量的重要评估指标，可以表征生物柴油自燃性。Krisnangkura K在1986年提出柴油的十六烷值与皂化值及碘值有线性相关性，并给出相关公式(Krisnangkura K.1986.A simple method for estimation of cetane index of vegetable oil methylesters.Journal of the American Oil Chemists′Society 63(4)：552-553.)。而且大量研究表明生物柴油的十六烷值，皂化值及碘值与其中各个不同脂肪酸甲酯的含量及组成密切相关(AzamMM，Waris A，Nahar NM.2005.Prospects and potential of fatty acid methyl esters of somenon-traditional seed oils for use as biodiesel in India.Biomass & Bioenergy 29(4)：293-302.)，并建立了相应的经验公式。本发明借鉴了该公式对生物柴油的质量进行了分析。

而生物柴油主要来源于细菌、真菌及微藻，尤其是微藻，具有不占用耕地，对生长条件要求较低，生长周期短，含油量相对较高，培养相对容易等优点，因而被称为最有潜力的生物柴油生物质来源之一。

目前，大量实验室培养和中试试验被用于微藻产柴油领域，现有研究表明，在非自养、缺氮或高密度等情况下，有助于微藻胞内油脂积累，但是对其中相关的代谢机制却仍旧不甚明了，这也成为了工业上大规模使用微藻生产生物柴油的一个关键限制性因素。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过高通量的代谢组学的手段了解微藻产油过程中的代谢物变化规律，进一步揭示与产油相关的代谢变化机制，从而为现有工艺提供优化方向的利用代谢组学改进微藻培养条件以提高产油能力的方法。

本发明的技术方案概述如下：

利用代谢组学改进微藻培养条件以提高微藻产油能力的方法，包括如下步骤：

(1)对微藻胞内的代谢物进行测定：

①细胞收集及淬灭：

对微藻进行培养，在培养过程的指数中期、后期和稳定期三个时间的至少一个时间点取出藻液样品100-150mL，每个时间点取出3-5份，4℃下3000-5000rpm，离心3-4min，收集下层的细胞，用3-5mL代谢终止液在-40℃下淬灭5-10分钟，终止代谢反应，在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；

所述代谢终止液为含有1500mg·L^-1 NaNO₃，36mg·L^-1 CaCl₂·2H₂O，75mg·L^-1MgSO₄·7H₂O和40mg·L^-1K₂HPO₄·3H₂O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1∶2；

②提取细胞内代谢物：

取步骤①获得的冻干细胞15-25mg分别置于离心管中，每管加入1-2mL-40℃的代谢提取液，混匀，盖紧并放入液氮中，反复冻融3-5次，在-20℃下4000-6000rpm离心1-2min，收集上清，另向残渣中加入0.5-1mL代谢提取液，-20℃下4000-6000rpm离心1-2min，离心后，两次上清液混合，加入10-20μg氘标记琥珀酸，得混合液，取200μL混合液，在-80℃下冷冻干燥2-4小时；