[发明专利]羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用试剂盒，其特征在于：它包括扩增反应液管、钙黄绿素显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管 管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO1的60 mmol/L的羊痘病毒内引物上游1.0 μL；

DNA序列为SEQ ID NO2的60 mmol/L的羊痘病毒内引物下游1.0 μL；

DNA序列为SEQ ID NO3的5 mmol/L的羊痘病毒外引物上游1.0 μL；

DNA序列为SEQ ID NO4的5 mmol/L的羊痘病毒外引物下游1.0 μL；

2×LAMP buffer 缓冲液 12.5μL；

5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL；

灭菌去离子水 3.7μL；

合计21 μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管，管内为羊痘病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μL；

序列为SEQ ID NO5的PCR上游引物和序列为SEQ ID NO6的PCR下游引物按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pmd19载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA;

所述阴性对照管，管内为无羊痘病毒感染的健康牛上皮组织基因组DNA，体积为20μL；

所述钙黄绿素显色剂管，管内体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

2.根据权利要求1所述一种羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用试剂盒，其特征在于：所述2×LAMP buffer 缓冲液由以下成分组成：

40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐，20mmol/L氯化钾，20mmol/L硫酸胺，体积百分比浓度为1% TritonX-100，0.8mol/L Betaine，7.5mmol/L 氯化镁和1.2mmol/L dNTP。

3.一种羊痘病毒属等温扩增技术快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的病毒DNA提取试剂盒，提取样品中的羊痘病毒DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：21μL扩增反应液，1μL钙黄绿素显色剂；3μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25μL;

3）羊痘病毒的等温扩增：将配制好的步骤2）中的扩增反应体系的PCR管于62～64℃恒温反应60min，80℃反应10min终止反应；

4）结果判定：反应产物显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

4.一种羊痘病毒属等温扩增技术快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的病毒DNA提取试剂盒，提取样品中的羊痘病毒DNA，获得待检模板DNA； 

2）扩增反应体系为：21μL扩增反应液，1 μL灭菌去离子水；3μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25μL;

3）羊痘病毒的等温扩增：将配制好的步骤2）中的扩增反应体系的PCR管于62～64℃恒温反应60min，80℃反应10min终止反应；

4）结果判定：通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显白色浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。