[发明专利]羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种羊痘病毒属病毒等温扩散技术快速检测用引物、试剂及其检测方法。

背景技术

羊痘病毒属病毒（Capripoxvirus,CPV）主要包括山羊痘病毒（Goatpox Virus,GTPV）、绵羊痘病毒（Sheeppox Virus,SPPV）和牛疙瘩皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus,LSDV）三种，能引起山羊、绵羊和牛的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿，病畜产乳量急剧减少，皮毛品质极大下降，造成巨大经济损失。山羊痘、绵羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”，是羊的一种急性、热性、接触性传染病。绵羊痘和山羊痘，被我国列为一类传染病，对畜牧业养殖影响重大。据不同毒株的毒力差异，易感羊群的致死率可达10%～58%或 75%～100%不等。羔羊致死率可达 100%，妊娠母羊极易流产。同时，因自由贸易受到限制造成了国家税收的下降，致使此病也成为了重要的经济疾病。该病呈世界性分布，我国近年来在如广西、贵州、黑龙江、甘肃等地也有发生。牛疙瘩皮肤病病毒引起牛的疙瘩皮肤病，又称牛结节性皮炎或块状皮肤病，是以患牛发热、皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病，感染率为5%～85%，病死率为10%；我国目前尚无牛疙瘩皮肤病病毒流行的报导，国内也无检测该病的相关研究，然而本病在公共卫生方面具有一定的意义，印度和斯堪的纳维亚都有人类感染羊痘病毒的报道。在印度，管理患病动物的人有的手和腿上发生红色丘疹，继而出现水疱并结痂，但未见有全身性的扩散。张瑞阳等（2003）首次报道了我国人感染羊痘的病例，病人手指、口唇、面颊等部位出现丘疹。携带有病毒的牛羊肉存在使人患病的可能性，对于食品安全存在潜在的隐患，因此本发明的试剂盒和检测方法在动物商品及其食品的出入境的快速检验检疫中具有重大的意义。

痘病毒（Capripoxvirus,CPV）在分类上属于痘病毒科（poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（chordopoxrinae）中的羊痘病毒属（Capripoxvirus）。羊痘病毒为砖形病毒，在细胞浆内复制，其基因组为双链 DNA。其大小约为 290nm×270nm，属于较小的痘病毒，病毒粒子由1 个核心、2个侧体和2 层脂质外膜组成，羊痘病毒的衣壳为对称型，有囊膜，囊膜内含有病毒特异性蛋白。 该病毒对干燥有较强的抵抗力，在干燥的痂皮内可存活 3-6 个月，在干燥羊舍内可存活 6-8个月。反复冻融对其没有明显的灭活作用。对直射阳光、常用消毒药（酒精、碘酒等）以及乙醚或氯仿较敏感。放线菌素-D和溴脂氧尿苷可抑制病毒复制。 

山羊痘、绵羊痘和牛疙瘩皮肤病病毒很强的宿主特异性，自然条件下，不会发生交叉感染。本病毒对上皮细胞有特殊亲和力，因此无论通过哪种途径进入机体的病毒，最终都经血液达到皮肤和粘膜，在上皮细胞内增殖，引起一系列的炎症过程而发生特异性的痘疹。山羊和绵羊均为易感动物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑随风和灰尘吸入呼吸道而感染，也可以通过损伤的皮肤及消化道传染。丘疹中含大量病毒，黏膜上的丘疹破溃后可从鼻、口分泌物和泪液排泄病毒。病毒进入乳汁、尿液和精液也可成为病毒传播的重要来源。被病羊污染的用具、饲料、垫草，病羊的粪便、分泌物、皮毛和体外寄生虫（如羊虱）都可以成为传播媒介。该病以春秋两季多发，主要在冬季春初流行，常呈地方性或广泛流行。气候严寒、雨雪、霜冻、枯草和饲养管理不良等因素都有助于本病的发生和加重病情。目前控制该病最有效的方法还是使用高效疫苗对易感动物进行免疫接种。

环介导等温扩增基因技术（loop-mediated isothermal amplication ,简称LAMP）（国际专利公开号 WO 00/28082）是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在65℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的两对引物是针对靶基因的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需要PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。