[发明专利]一种羰基还原酶及其基因和在不对称还原羰基化合物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，该羰基还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯等前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。

背景技术

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(分子式为C₆H₅(CH₂)₂CH(OH)COOCH₂CH₃，分子量为208.25，CAS号：90315-82-5)是合成多种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)普利药物，如贝那普利、西拉普利等的重要手性砌块。该类药物主要用于治疗高血压、充血性心力衰竭等疾病。在抗高血压药物市场中，与非肽类血管紧张素II受体抑制剂、钙通道拮抗剂形成了三足鼎立的市场格局。国内对普利原料药需求旺盛，价格稳定，尤其是贝那普利等紧俏产品，主要依赖进口。因此，研究(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的手性合成具有广阔的应用前景。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、高转化率、高对映体选择性等多种优点。生物法又包括动力学拆分法和不对称合成法。其中，不对称合成法由于可实现100％的理论产率，更受研究者的青睐。

不对称合成法所研究的较多是用野生菌或重组工程菌的细胞或游离酶进行催化。在已报道的不对称合成方法中，底物浓度的最高水平是400mM(82g/L)，所用催化剂为预处理的面包酵母(Baker’s yeast)，但是反应48h后仅有41.9％的底物转化成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，且对映体过量值(ee)只有87.5％(Biocatal.Biotransfor.2009，27，211-218)。很多其他报道可以达到高对映选择性的催化，但是生成的产物浓度一般都很低，不具备产业化的可行性。Zhang等用克鲁氏假丝酵母(Candida krusei SW2026)不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，在底物浓度为2.5g/L时，ee值99.7％，分离得率95.1％。但当底物浓度提高到20g/L后，ee值降低到97.4％(Process Biochemistry 2009，44，1270-1275)。Lavandera等用重组醇脱氢酶催化还原5g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，ee值99％以上，但是需要外源添加1mM NADH(ChemSusChem 2008，1，431-436)。林文清等用筛选的博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)等，在水相和水/有机两相两相体系中，催化还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，产品ee值为84.9％-98.88％，然而该方法的产物浓度也不高，最高为50g/L(中国专利，公开号CN 101314784A)。

以上方法仅限于实验室规模，且存在产物浓度不高，需要添加昂贵辅酶，以及反应时间长等缺陷，不适合用于工业化生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(一般要求产物浓度应在100g/L以上)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的生物催化不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应中酶催化活性偏低、底物耐受性差、产物浓度不够高，以及需要额外添加昂贵辅酶、反应时间长等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好、反应时间短、无需额外添加辅酶的羰基还原酶，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该羰基还原酶在催化还原其他酮类底物中的用途。特别地，将该酶用于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备中，不仅催化反应时间短，而且不需要额外添加昂贵的辅酶NADP⁺或NADPH。

本发明通过下述技术方案以解决现有的生物法不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中存在的技术问题：

本发明提供一种羰基还原酶，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。