[发明专利]一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法

权利要求书

1.一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其步骤如下：

（1）种子的培养

将双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohniiATCC30556）接种于种子培养基中，接种量体积百分比为5~10%，培养温度为26~30℃，摇床转速160~200r/min，培养24~48h至对数期；

（2）种子液的预处理

取步骤1培养至对数期的细胞，4000 r/min转速下离心5~10min，0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2~3次，稀释40~80倍后，经无菌玻璃珠打散，6 层无菌纱布过滤得单细胞悬浮液；

（3）原生质体的制备及紫外诱变处理

将适量的原生质体化反应液，即步骤2单细胞悬浮液、酶液及渗透压调节剂按1：1~4：20~35比例组成的混合液，在25~30℃条件下处理20~30 min；酶解液过滤，离心分离，洗涤并稀释至10⁶个/mL，得原生质体纯化液；

该原生质体纯化液先以0.8% LiCl进行预处理，然后置于有磁力搅拌棒的无菌培养皿中，菌液厚度不超过2mm，加盖，开紫外灯预热20min，在15W~30W紫外灯下，距离30cm处的磁力搅拌器上，放置培养皿，缓慢搅拌，打开皿盖进行紫外照射5~30 min，取出培养皿，梯度稀释，整个过程在红光下操作；26~30℃培养4~7d；

（4）硫酸二乙酯诱变处理

取步骤3得到的原生质体纯化液加体积百分数为10%的硫酸二乙酯，于160~200r/min振荡混合处理5~10min，加入1mL 25%的硫代硫酸钠终止反应；将反应液稀释500~1000倍并于添加了氧化还原剂红四氮唑（TTC）的固体培养基上，26~30℃培养4~7d；

（5）耐丙二酸和高糖菌株的筛选

挑选TTC活性最强，即生长速度较快，染色较深、较大的菌落作为初筛获得的菌株，这些菌株DHA的积累量相对较多，将这些正变株重新活化后，制备单细胞悬液，并分别涂布于含0.05%丙二酸平板和/或高糖平板培养基上26~30℃培养4~7d；

（6）摇瓶复筛

将上述抗性平板上生长较快、较大的菌落接种于种子培养基中进行传代培养，然后分别进行摇瓶发酵，在发酵培养基中，26~30℃培养3~5d；测定发酵液中菌体的脂肪酸含量和DHA含量，并以此作为筛选指标，获得较高产量的正变株。

2.根据权利要求1所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其特征是：步骤1中所述种子培养基组成：葡萄糖40~80 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO₄.7H₂O 4~8 g/L，KH₂PO₄ 0.5~1.0 g/L，KNO₃ 1~5 g/L，酵母粉 2 ~8 g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.2~0.5 g/L，NaHCO₃ 0.08~0.12 g/L，MnSO₄ 0.5~1.0 μg/L，维生素B₁ 0.01~0.04mg/L，维生素B₆ 0.001~0.006mg/L，初始pH6.0~7.0。

3.根据权利要求1所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其特征是：步骤4所述固体培养基组成：葡萄糖40~100 g/L，NaCl 15~25g/L，MgSO₄.7H₂O 4~8 g/L，KH₂PO₄ 0.5~1.0 g/L，KNO₃ 1~5 g/L，酵母粉 2 ~8 g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.2~0.5 g/L，NaHCO₃ 0.08~0.12 g/L，MnSO₄ 0.5~1.0 μg/L，维生素B₁ 0.01~0.04mg/L，维生素B₆ 0.001~0.01mg/L，琼脂粉20 g/L，初始pH6.0~7.0。