[发明专利]一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法。

背景技术

DHA（二十二碳六烯酸）是一种具有特殊结构（非共轭体系的6个顺式构型双键）的多烯脂肪酸，根据其甲基端最后一个双键的位置它属于ω-3系列的典型长链高度不饱和脂肪酸。人体内的DHA主要分布于大脑灰质、视网膜细胞外节、神经系统、母乳、心肌、嗜酸性白细胞、精子等处，其生理作用有：抑制血小板凝集；降低血液中中性脂质；降低极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的胆固醇及升高高密度脂蛋白胆固醇；降低血液粘度；补脑健脑，预防老年性痴呆症；提高视力，防治近视；通过对DNA聚合酶和DNA拓扑异构酶的抑制效应达到预防癌症效果等。

传统从鱼油提取的DHA，数量有限，难以满足不断增长的市场需求。因此，DHA生产研究逐渐向利用生物技术合成方向发展。利用生物技术合成DHA具有周期短，脂肪酸构成简单及有较大的生产潜力等优点，而且不受原料的限制，微生物发酵法生产的DHA没有从鱼油中提取的DHA的鱼腥味，更有利于DHA的应用。

常用的微生物包括破囊壶菌、裂殖壶菌和海洋微藻等。与其它微生物相比，海洋微藻是最为理想的 DHA来源，培养藻类生产 DHA的产率比利用真菌和细菌培养高出 1~2 个数量级。海洋微藻所含有的独特的生理活性物质使得它们具有多种药用价值和保健功能，利用海洋微藻生产多不饱和脂肪酸尤其是 DHA 的研究，已成为各国科研人员研究开发的热点。双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohnii ATCC30556）的DHA含量达30%以上，它高生物量、高生长速率、高DHA含量、异养培养生长良好，且不含有EPA（二十碳五烯酸），是DHA的较好产生菌之一。目前公开的利用海洋微藻生产DHA的专利中，DHA油脂的产量均不高，原因与所用菌种及采用的发酵培养工艺有关。因此，如何选育出更优良的双鞭甲藻品系和优化该菌的培养工艺，以提高市场竞争力成为科研工作者研究的课题之一。

发明内容

本发明的目的，是要提供一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，它摒弃现有技术的缺陷，采用原生质体诱变技术，并结合代谢调控发酵育种的基本思路，定向选育出DHA含量较高的双鞭甲藻菌株，并对该菌株的培养工艺进一步优化，获得高产量的正变株。

本发明是这样实现的，所述一种DHA产生菌双鞭甲藻的诱变筛选方法，其步骤如下：

（1）种子的培养

将双鞭甲藻（Crypthecodinium. cohniiATCC30556）接种于种子培养基中，接种量体积百分比为5~10%，培养温度为26~30℃，摇床转速160~200r/min，培养24~48h至对数期；

（2）种子液的预处理

取步骤1培养至对数期的细胞，4000 r/min转速下离心5~10min，0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2~3次，稀释40~80倍后，经无菌玻璃珠打散，6 层无菌纱布过滤得单细胞悬浮液；

（3）原生质体的制备及紫外诱变处理

将适量的原生质体化反应液，即步骤2单细胞悬浮液、酶液及渗透压调节剂按1：1~4：20~35比例组成的混合液，在25~30℃条件下处理20~30 min；酶解液过滤，离心分离，洗涤并稀释至10⁶个/mL，得原生质体纯化液；

该原生质体纯化液先以0.8% LiCl进行预处理，然后置于有磁力搅拌棒的无菌培养皿中，菌液厚度不超过2mm，加盖，开紫外灯预热20min，在15W~30W紫外灯下，距离30cm处的磁力搅拌器上，放置培养皿，缓慢搅拌，打开皿盖进行紫外照射5~30 min，取出培养皿，梯度稀释，整个过程在红光下操作；26~30℃培养4~7d；

（4）硫酸二乙酯诱变处理

取步骤3得到的原生质体纯化液加体积百分数为10%的硫酸二乙酯，于160~200r/min振荡混合处理5~10min，加入1mL 25%的硫代硫酸钠终止反应；将反应液稀释500~1000倍并于添加了氧化还原剂红四氮唑（TTC）的固体培养基上，26~30℃培养4~7d；

（5）耐丙二酸和高糖菌株的筛选

挑选TTC活性最强，即生长速度较快，染色较深、较大的菌落作为初筛获得的菌株，这些菌株DHA的积累量相对较多，将这些正变株重新活化后，制备单细胞悬液，并分别涂布于含0.05%丙二酸平板和/或高糖平板培养基上26~30℃培养4~7d；

（6）摇瓶复筛