[发明专利]一种防止拜氏梭菌菌株退化的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物医药领域，涉及一种防止拜氏梭菌菌株退化的方法，尤其是一种拜氏梭菌人工退化菌株模型及一种防止菌株退化的方法。

背景技术：

在分解糖产酸的梭状芽孢杆菌属种，有一些种类的细菌可以在一定条件下在生长后期产中性溶剂(丙酮acetone、丁醇butanol、乙醇ethanol，常被称为ABE)。1861年巴斯德首次发现细菌可以产生丁醇，1912年Weizmann发现梭菌Clostridium acetobutylicum可以转化淀粉产生丙酮、丁醇、乙醇，1990年以前这些细菌被统称为产丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，后来通过16s rRNA等进一步分类，分出其他3种生长条件相同、产溶剂种类产量类似的C.beijerinckii，C.saccharobutylicum，C.saccharoperbutylacetonicum.这也就是主要产溶剂的四种梭菌，属于梭状芽孢杆菌属(Clostridium)。目前主要的丙酮丁醇发酵菌株为丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC824和拜氏梭菌C.beijerinckii NCIMB8052，并且这两株菌的全基因组序列分别于2001年和2007年测定完成。近年来，利用厌氧梭菌发酵法生产生物丁醇作为很有潜力的液体燃料成为研究热点。

拜氏梭菌，革兰氏阳性细菌，严格厌氧，可利用普通淀粉(玉米、小麦、谷类等)、糖类作为发酵底物进行厌氧发酵产溶剂，一般来讲，定量发酵中，ABE产量(12-20g/L)为20-30％丙酮，60-70％丙醇和10％的乙醇。其代谢过程过程分为2个阶段：产酸阶段，此阶段产酸途径被激活，乙酸、丁酸、ATP、H₂、CO₂为主要代谢产物，培养基的pH从6.3迅速下降至4.5。产酸阶段细胞将游离有机酸分泌至胞外，当培养基中的游离有机酸浓度与电离的酸根离子达到平衡，培养基的缓冲能力降低，细胞生长受到一定抑制；细胞进入芽孢生长期的同时也进入产溶剂阶段，培养基中的游离有机酸被重新吸收进细胞内合成为丙酮和丁醇。溶剂产生过程主要由acetoacetyl-CoA：acetate/butyrate-coenzymeA transferase(CoA transferase)和其他几种butyraldhyde/butanol dehydrogenase，acetoacetate decarboxylase所催化。细胞从产酸代谢向产溶剂代谢的转变，芽孢形成与溶剂产生的关联和调控是目前产溶剂代谢途径研究的热点问题，对产溶剂期相关酶的增强转录及诱导表达及产酸期相关酶的抑制的机制和途径被认为是这个转折点的关键。

在产溶剂梭菌的厌氧发酵过程中的菌株退化(degeneration)是目前研究的一个重要方面，也是限制其规模发酵的一个重要因素，其表现为在连续传代中菌株完全或者部分丧失了产溶剂的能力，并且是不可逆的。细胞一直处于产酸生长期，胞外积累大量的有机酸，细胞不能进入产溶剂期，这些有机酸没有被重新吸收转化，过量的有机酸使得细胞中毒死亡。在C.acetobutylicum ATCC824中，大质粒pSOL1上含有产溶剂期相关酶基因(aad、ctfA、ctfB)，连续培养中该质粒的丢失被认为是造成菌株退化的直接原因，退化菌株C.acetobutylicum中外源表达这些基因则可恢复丁醇的产量达野生型的50％左右；在C.beijerinckii NCIMB8052中也出现不可逆的菌株退化、不产溶剂现象的出现，但是C.beijerinckii NCIMB8052细胞中并没有大质粒，所有的与产溶剂相关的基因都位于基因组上；同时退化的C.beijerinckii NCIMB8052菌株中可以检测到产溶剂期相关酶基因序列的存在。因此，不同的产溶剂梭菌具有不同的控制产溶剂退化的机制，而在C.beijerinckii NCIMB8052中这个调控机制是未知的，因此迫切需要研究其菌株退化发生机制，并找出有效控制菌株退化的方法。

目前的研究并没有关于C.beijerinckii菌株退化机制的相关报道，并且对于已发生退化的菌株并没有有效的技术手段使其恢复产溶剂代谢的能力。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种防止拜氏梭菌菌株退化的方法，以C.beijerinckii NCIMB8052位研究对象，人工获得退化菌株模型，研究退化菌株的代谢，并通过碳酸盐来调节细胞外游离的有机酸的浓度来恢复退化菌株产溶剂的能力。