[发明专利]一种鉴别牛分枝杆菌的PCR引物及方法

权利要求书

1.一种用于PCR鉴别牛分枝杆菌的特异性引物组合，其特征在于，其分别能对分枝杆菌属细菌的16SrRNA保守区、结核分枝杆菌复合群MTBC的Rv0577基因，结核分枝杆菌RD7区域的Rv1970，牛分枝杆菌pncA基因和RD1区基因进行扩增，生成特异性扩增片段。

2.如权利要求1所述的PCR鉴别用引物组合，包括：

116SrRNA-F    5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGT T TC-3’；

16SrRNA-R    5’-TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’；

2MTBC-F    5’-ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’；

MTBC-R    5’-CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’；

3MT-F    5’-GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’；

MT-R    5’-CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3’；

4PncA-F    5’-CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3’；

PncA-R    5’-CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’；

5RD1-F    5’-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’；

RD1-R    5’-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3’。

3.一种鉴别牛分枝杆菌的PCR方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物分别进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。

4.如权利要求3所述的方法，还包括：当待测菌为未知菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第1～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为分枝杆菌属细菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第2～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为结核分枝杆菌复合群细菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第3～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为结核分枝杆菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第4～5对引物组合，分别进行PCR扩增；或

当待测菌为牛分枝杆菌细菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第5对引物，进行PCR扩增；反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。

5.如权利要求3或4所述的PCR方法，其特征在于，

含有16SrRNA、MTBC、PncA引物对的PCR的反应程序为：预变性94℃、5min，再经94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s，31个循环，最后72℃延伸10min；或

含有MT引物对的PCR的反应程序为：预变性94℃、5min，再经94℃变性40s，61℃退火40s，72℃延伸40s，31个循环，最后72℃延伸10min；或

含有RD1引物对的PCR的反应程序为：预变性94℃、5min，再经94℃变性40s，62℃退火40s，72℃延伸40s，31个循环，最后72℃延伸10min。

6.如权利要求5所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系，其中20μl反应液的具体配置为：

7.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，样品总DNA来自分离的菌种资源或动物组织。

8.一种鉴别牛分枝杆菌的试剂盒，其包括，权利要求1或2所述的引物组合。

9.权利要求1或2所述的引物对在制备用于检测及鉴别牛分枝杆菌试剂中的用途。

10.权利要求1～2所述的引物或权利要求3～4所述的方法在制备预防结核病疫苗中的应用。