[发明专利]一种鉴别牛分枝杆菌的PCR引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测鉴别技术，具体地说涉及对牛分枝杆菌进行PCR鉴别用引物及使用该引物的PCR鉴别方法。

背景技术

牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性传染病，该病可通过病畜或其产品传染给人类或其他动物。感染牛结核分枝杆菌的大多数牛不呈显性感染或仅到晚期才出现临床症状，故早期临床诊断不易获得准确结果。病原学检查是最确实的方法之一，病理学检查可以根据特征病变确诊，但必须在动物死亡或宰杀后进行且所需确诊周期长，需3-8周，所以常常不被实际工作所采用。由于牛奶、牛肉等食品与人类生活息息相关，结核杆菌可侵犯人和动物的全身各器官，以肺结核最常见。因此及时确定病原菌，合理进行牛结核病的防控有利于保障公共卫生安全。

结核分枝杆菌复合群(MTBC)包括结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌I型和II型、牛分枝杆菌、卡介苗、田鼠分枝杆菌、caprae分枝杆菌以及canettii分枝杆菌。目前临床上鉴别牛结核杆菌的方法最广泛的是变态反应诊断，但该法存在着极强的非特异性反应，即在相当数量的结核变态反应阳性牛中，既找不出特征病变，又不能分离出结核杆菌，或仅仅分离出非典型的分枝杆菌，而且妊娠母牛仍然检出率低，在重复检疫时阳性率下降，因此在实际工作中用于诊断牛结核病并不十分理想。

近年来，以聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR为代表的分子生物学技术在结核或副结核病原菌快速检测鉴别方面发展较快，但均为针对结核分枝杆菌复合群，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌单独菌种的方法，也有直接通过基因分型方法直接鉴别出分枝杆菌各种型的，然而这些方法有的只给出了鉴别单独菌株的引物，有的给出了很多信息，却没有进行灵敏度试验，这对于临床运用是不够完善的，有的不够经济，成本较高，如荧光定量PCR。例如2002年Richard C.Huard等建立了鉴别分枝杆菌复合群中各菌株的PCR方法，能特异性的鉴别出MTBC中的各种菌；2007年张鹭等根据牛分枝杆菌MPB70的特异性基因序列进PCR扩增，检测牛奶中的MTBC，阳性率达到40.9％，灵敏度达到40ng/L；2007年孟祥红等人建立了多重PCR技术可以快速鉴别结核分枝杆菌和非分结核分枝杆菌，应用多重PCR法与BACTEC培养的结果有很高的一致性，为临床结核病和分枝杆菌病的鉴别诊断提供了有效的手段；2010年贾广乐等根据IS1081序列设计荧光定量PCR引物及探针，建立了牛结核病TaqMan荧光定量PCR检测方法。上述方法，都只是单独的给出了鉴别某一种菌的PCR相关方法，有的采用探针杂交，荧光定量等经济成本较高的方法，这些都不利于临床检测样品，目前还没有系统地使用整套引物对分枝杆菌属类的主要细菌进行鉴别的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别牛分枝杆菌的PCR用引物及PCR鉴别方法。

本发明用于PCR鉴别牛分枝杆菌的特异性引物组合，用于鉴别分枝杆菌属、结核分枝杆菌复合群、结核杆菌、牛分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG株。其分别能对分枝杆菌的16SrRNA保守区、结核分枝杆菌复合群(MTBC)Rv0577基因，结核分枝杆菌RD7区域的Rv1970，牛分枝杆菌pncA基因和RD1区基因进行扩增，生成特异性扩增片段。

本发明提供的牛分枝杆菌PCR鉴别用引物组合，包括：

1    16SrRNA-F    5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’；

16SrRNA-R    5’-TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’；

2MTBC-F    5’-ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’；

MTBC-R    5’-CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’；

3MT-F    5’-GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’；

MT-R    5’-CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3’；

4PncA-F    5’-CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3’；

PncA-R    5’-CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’；

5RD1-F    5’-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’；

RD1-R    5’-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3’。

本发明提供一种牛分枝杆菌PCR鉴别方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物组合分别进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。