[发明专利]一种检测肺癌易感基因的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种检测肺癌易感基因的方法及试剂盒。

背景技术

易感基因是指和特定疾病具有一定关联的基因或等位基因。对复杂疾病的易感基因进行检测，得到其具体的序列信息，然后结合后续进一步的分子生物学试验、临床试验、临床观察以及综合数据的统计分析，建立一定的疾病模型，可以实现早期评估疾病的易感性并采取相应预防措施降低疾病的发生几率。大量研究证实遗传因素在疾病的易感性中发挥重要作用，复杂疾病的遗传因素己证实存在微效基因剂量效应，即多个微效基因的作用相互累加进而形成明显的表型综合效应。因此，对疾病的多个易感基因及突变位点(特别是针对基因组中最主要的遗传突变形式——单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)，它约占整个基因组中遗传突变的92％)进行检测至关重要。

肺癌发生于支气管粘膜上皮，亦称支气管肺癌。随着工业发展，大气污染加剧，在全球范围内肺癌发生率与死亡率每年都以4.5％的速度快速递增。肺癌成为死亡率最高的一种癌症，一方面是目前仍没有特别有药物与治疗方案，10-15％的低治愈率，另一方面是肺癌发现一般都是晚期，甚至癌细胞已经发生了转移。临床表明，越早发现，肺癌患者生存率越高。

肺癌易感基因为初步研究可能与肺癌有一定关联的基因，其中各易感基因的关联度有高有低。目前，检测肺癌易感基因的方法最常见的是Sanger测序法，该方法能对肺癌易感基因进行区域检测，但Sanger测序法每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，测序成本高，灵敏度低(20％)，无法得出各突变位点发生变异的精确数据。

此外，虽然针对肺癌易感基因检测以及SNP位点的研究成果已经很多，但现有技术适用于针对单个SNP位点进行检测及分析，不适于对多SNP位点进行联合检测和分析，检测结果均不够准确全面。

因此需要一种检测肺癌易感基因的新方法，能对肺癌易感基因的多个区域同时进行检测，准确得出这些区域的序列信息，包括已知突变和未知突变的各突变位点的变异情况，检测灵敏度高，并能进一步同时对大量样品检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测肺癌易感基因的方法及相应的试剂盒，能对肺癌易感基因的多个目标区域同时进行检测，得出这些区域的准确序列信息，包括已知突变和未知突变的各突变位点的变异情况，检测灵敏度高，并能进一步同时对大量样品进行检测。

为了实现发明目的，一种检测肺癌易感基因的方法，包括以下步骤：

A.利用肺癌易感基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，并基于扩增产物构建测序文库；

B.对测序文库进行单分子扩增，得到与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；

C.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得到所述多个目标区域的序列信息。

其中，所述步骤A包括：

A1.利用肺癌易感基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得到与所述多个目标区域对应的扩增产物；

A2.利用接头元件，与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得到测序文库；所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。

其中，步骤A2包括以下步骤：

A21.对与所述多个目标区域对应的扩增产物进行片段化，得到片段化产物；

A22.利用接头元件，与片段化产物进行连接，构建测序文库。

其中，所述步骤A22包括以下步骤：

A221.利用第一接头与片段化产物的两端连接，得第一连接产物；

A222.环化第一连接产物，得环化产物；

A223.II s型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物；

A224.在酶切产物两端接上第二接头和第三接头，得测序文库。

其中，所述步骤A22包括以下步骤：

A221’.利用第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；

A222’.II s型限制性内切酶酶切第二连接产物，得带有第四接头的酶切片段；

A223’.带有第四接头的酶切片段与第五接头连接，形成测序文库。

其中，步骤A2所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库做上相应的标记。所述第一标签序列，优选为带有特定序列的核酸分子，其碱基数不限。