[发明专利]一种葡聚糖外切酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种葡聚糖外切酶及其编码基因与应用。

背景技术

纤维素是自然界最丰富的可再生资源，其高效利用已成为目前发展生物质能源的瓶颈和重大的科学问题。

纤维素能够在纤维素酶系的协同作用下转化为葡萄糖。纤维素酶系包括葡聚糖内切酶(endoglucanase，EG)，葡聚糖外切酶(cellubiohydralases，CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases，BG)。

外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维糊精和纤维二糖，在纤维素的降解中起重要的作用。

目前，纤维素酶的活性较低严重制约了纤维素的高效利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡聚糖外切酶及其编码基因与应用。

本发明提供的葡聚糖外切酶，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组表达载体可为将所述基因插入pYES2/CT质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

所述重组菌可为将所述重组质粒导入酵母细胞得到的重组菌。所述酵母优选为酿酒酵母。所述酿酒酵母优选为酿酒酵母INVSc1。

本发明还保护一种制备所述蛋白质的方法，包括如下步骤：发酵所述重组菌，得到所述蛋白。所述发酵的条件具体可为：30℃、200rpm振荡培养18-72小时(18小时、24小时、30小时、48小时或72小时)。

所述方法具体可包括如下步骤：

①将所述重组菌接种于YPD培养基，30℃、200rpm振荡培养18-72小时，得到的菌液(OD600具体可为2.2)；

②将步骤1的菌液1500g离心5min，收集沉淀(菌体)；

③将步骤②的菌体破碎并收集上清，即为含有所述蛋白质的溶液。

所述步骤③具体可为：在步骤②的菌体中加入破碎缓冲液，再加入玻璃珠，在涡旋振荡器上振荡7min，然后30000g离心5min，收集上清。

所述破碎缓冲液具体可为如下缓冲液：由溶质和溶剂组成；溶剂为pH 7.4、50mM的磷酸钠缓冲液；溶质及其在破碎缓冲液中的浓度如下：1mM EDTA，体积百分含量为5％的甘油，1mM PMSF。

所述YPD培养基的制备方法具体如下：将1g酵母提取物、2g蛋白胨和2g葡萄糖溶解于100mL蒸馏水。

本发明还保护所述蛋白在作为葡聚糖外切酶中的应用。所述应用具体可为应用所述蛋白将对硝基苯纤维二糖苷降解为对硝基苯酚。所述应用具体可在反应缓冲液中进行。所述反应缓冲液具体可为pH 5.0、50mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。所述应用的具体条件可为：50℃水浴反应1小时。