[发明专利]水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酶解的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酸酶的方法，特别是通过检测透明质酸酶解后的分子量变化来确定交联透明质酸是否酶解完全。

背景技术

开发能应用与临床的皮肤填充剂，就必须对透明质酸进行一系列的化学修饰和处理过程。如果采用非交联的透明质酸作为皮肤填充剂，那么，在皮肤中天然存在的透明质酸酶与自由基就会一个一个的切断聚合起来的透明质酸分子，快速降解非交联的透明质酸。结果使得透明质酸在组织内的半衰期只有一天到两天，然后经过水的稀释，在肝脏内逐步降解为水和二氧化碳。这样，产品在注射的部位就会很快的失去效用(在一周内)，结果使得非交联的透明质酸在皮肤中的滞留时间受到了很大的限制。因此，非交联的透明质酸起不到一个作为皮肤填充剂应该起到的疗效。所以，采用1，2，7，8-二环氧辛烷作为透明质酸的交联剂，将透明质酸的羟基和羧基都交联起来，提高了透明质酸分子的稳定性，有效地防止了透明质酸酶和自由基对透明质酸的降解作用，可明显地提高透明质酸在皮肤内的停留时间，具有量好的作为皮肤填充剂应有的疗效。

因为交联透明质酸在体内的降解的主要因素就是透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)，所以，透明质酸的体外酶解实验就可以从一个侧面验证透明质酸在体内的停留时间。通常的酶解方法都是称取一定质量的交联透明质酸凝胶，在37℃下，加入一定量的透明质酸酶，在一段时间后，通过测量酶解前后的质量差，或者通过咔唑法测定酶解后葡萄糖醛酸的含量来确定透明质酸的酶解程度。但是，此种方法选用的都是成为一个整体的大块状的交联透明质酸凝胶，若交联透明质酸被粉碎为微小颗粒并作为产品之后，再用此种方法去检测产品的酶解程度就会具有很大的局限性，因为微小的颗粒会影响检测结果，并造成不小的误差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酸酶的方法。采用水相凝胶渗透色谱法(GPC)检测交联透明质酸体外透明质酸酶的酶解程度，通过检测透明质酸酶解后的分子量变化来确定交联透明质酸是否酶解完全。本发明方法简单，容易操作，成本低廉，安全可靠。

本发明提供的一种水相凝胶渗透色谱法检测交联透明质酸体外酸酶的方法包括如下步骤：

1)取1mL微小颗粒状的交联透明质酸产品于比色管中，加入300单位的透明质酸酶，用水稀释至2mL，于37℃恒温水浴振荡器中，从稀释后开始计时，从第二十分钟开始，每二十分钟用微量注射器取50μL上清液，取出的上清液置于冰箱迅速冷却至5℃；

2)取3-5小时之内的酶解上清液，分别用水相凝胶渗透色谱(GPC)检测不同时段的上清液分子量，当分子量趋于常数时，则可确定该产品酶解完成。

具体色谱条件与试剂：

色谱条件：

色谱柱：Waters Part No.WA To11545 7.8×300mm Ultrahydrogel 250

流动相：去离子水；

泵：Waters 1515 Isocratic HPLC Pump；

检测器：Waters 2414 Refractive Index Detector；

柱流量：1.0mL/min；

柱温：35℃；

进样口温度：180℃；

检测器温度：300℃；

进样量：50～100μL；

内部加热：37℃；

柱压：1000psi，不高于2500psi；

pH范围：2～12；

有机相＜20％；盐浓度＜800mM；

分子量范围：1000＜Mn＜6×10⁶；

柱体积：6～12mL；

流动相改变值：＜0.3mL/min。

交联透明质酸是用1，2，7，8-二环氧辛烷作为透明质酸的交联剂，季铵碱作为碱催化剂与相转移催化剂合成。

本发明通过采用水相凝胶渗透色谱仪(GPC)检测透明质酸凝胶微小颗粒的酶解上清液的分子量变化来确定交联透明质酸的酶解程度。其原理在于，透明质酸颗粒被降解后，其被降解的片段会溶解进入上清液，酶解的时间越长，溶入上清液的片段分子量就会越小，当上清液的分子量趋于一个平衡不变的常数时，就可认为透明质酸已经酶解完全。本发明所介绍的方法在测量手段上更加简单，所得到的数据也更加直观的展现了交联透明质酸的整个酶解过程。

附图说明

图1为本发明中的透明质酸分子量与时间关系图。

具体实施方式

实施例1：

透明质酸凝胶的制备