[发明专利]III型火鸡疱疹病毒冻干疫苗

权利要求书

1.一种III型火鸡疱疹病毒疫苗，其特征在于，每支成品所含病毒蚀斑数不低于4×10⁶PFU的火鸡疱疹病毒，可稀释成2000羽份，每羽份蚀斑含量不低于2000PFU；其中，所述火鸡疱疹病毒为使用细胞工厂培养获得。

2.根据权利要求1所述疫苗，其特征在于，所述火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒HVT Fc126株病毒。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述III型火鸡疱疹病毒疫苗为冻干疫苗。

4.一种制备权利要求1或2所述的疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备鸡胚成纤维细胞悬液：选择鸡胚，采用连续消化法制备鸡胚成纤维细胞悬液，制成80～120万/ml的细胞密度，混匀后置于细胞工厂，置37℃培养箱静置培养24～36h，获得的鸡胚成纤维细胞单层；

2)接种工作毒种并培养病毒：

将获得的鸡胚成纤维细胞单层，弃去培养液，以每平方厘米接种2000PFU含量的火鸡疱疹病毒的工作毒种，接种至鸡胚成纤维细胞单层中，置37℃培养箱吸附1h后，补加2％w/v血清浓度的M199维持液至每层200ml，37℃继续培养；

3)收获：

培养至CPE达到70％以上时收获，弃去维持液，加入EDTA-胰酶混合消化液100～120ml/层，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入2％w/v血清浓度的M199维持液150～250ml/层，停止消化；收集消化的细胞分装至离心瓶中，于1500r/min离心10～20分钟，弃上清，收集沉淀细胞；

4)裂解：收集沉淀细胞，加入稳定剂SPGA摇匀，取样做收获前无菌检验，进行病毒计数后补加适量的SPGA，使每毫升所含的病毒蚀斑数不低于6×10⁶PFU/ml，无菌进行超声波裂解，裂解时间为1min；

5)分装：

取裂解完后过滤，分装小瓶每支1ml，即得III型火鸡疱疹病毒疫苗成品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒HVT Fc126株病毒。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的鸡胚成纤维细胞悬液培养时间为培养24h。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤4)的血清为血清I型、血清II或血清III。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤5中还包括冻干步骤，即冻干保存或加入冷冻保护液，定量分装，液氮保存。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述冻干步骤为：使用III型火鸡疱疹病毒疫苗成品，在-40℃入箱预冻，3～5h后进入干燥阶段，逐渐升高制品直至达到设定值后，保温2～4h，压塞出箱，-15℃以下保存，即获得III型火鸡疱疹病毒疫苗冻干苗。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤5)结束后还包括细胞工厂清洗过程：即用灭菌超纯水反复清洗用过的细胞工厂3～5次，包装好，进行钴源照射消毒后以备重复使用。