[发明专利]III型火鸡疱疹病毒冻干疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种III型火鸡疱疹病毒疫苗，特别是指一种III型火鸡疱疹病毒冻干疫苗。

背景技术

III型的火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗是由美国学者Writter RL博士从火鸡群中分离出来的1株无毒力品系，对鸡和火鸡均不致病，在鸡群内部传播，接种这种疫苗的鸡体，细胞中的HVT能使机体产生抗体，但不能中和MDV。该疫苗具有干扰作用。该疫苗的广泛应用，可有效抵抗强毒。既可以以细胞结合性方式存在，又有少量可游离于细胞外。其优点是可制成易于储存、便于运输的冻干苗，20世纪70年代开始，HVT疫苗发挥了巨大作用。

考虑到HVT疫苗保存、运输和使用方便，成本低廉，在卫生状况良好，未收到超强毒攻击的地区，仍使用HVT疫苗预防MDV的爆发，因此火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗在较长的时期内是不可能被完全取代的。然而，市场上的主要HVT疫苗基本是使用转瓶或摇瓶培养获得，上述方法的劳动强度大，占地空间大，操作过程易污染；单位体积提供的细胞生长面积有限，细胞密度低；培养的环境条件难以检测和控制，批间差异大，疫苗产量及质量受到极大限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种III型火鸡疱疹病毒疫苗及其制备方法，以实现使用细胞工厂生产一种质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定的III型火鸡疱疹病毒疫苗或冻干疫苗。

技术方案

本发明提供了一种III型火鸡疱疹病毒疫苗，每支成品所含病毒蚀斑数不低于4×10⁶PFU的火鸡疱疹病毒，可稀释成2000羽份，每羽份蚀斑含量不低于2000PFU。

其中，所述火鸡疱疹病毒为使用细胞工厂培养获得。

优选地，本发明所述的火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒HVT Fc126株病毒。

优选地，本发明所述的III型火鸡疱疹病毒疫苗为冻干疫苗。

本发明还提供了一种制备上述疫苗的方法，包括以下步骤：

1)制备鸡胚成纤维细胞悬液：选择鸡胚，采用连续消化法制备鸡胚成纤维细胞悬液，制成80～120万/ml的细胞密度，混匀后置于细胞工厂，置37℃培养箱静置培养24～36h；

2)接种工作毒种并培养病毒：

将步骤1)中培养24～36h生长状态良好的鸡胚成纤维细胞单层弃去培养液，以每平方厘米接种1000PFU～3000PFU含量的工作毒种，接种工作毒种，置37℃培养箱吸附1h后，补加2％w/v血清浓度的M199维持液至每层200ml，37℃继续培养；

3)收获：

培养至CPE达到70％以上时收获，弃去维持液，加入EDTA-胰酶混合消化液100～120ml/层，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入2％w/v血清浓度的M199维持液150～250ml/层，停止消化；收集消化的细胞分装至离心瓶中，于1500r/min离心10～20分钟，弃上清，收集沉淀细胞；

4)裂解：收集沉淀细胞，加入稳定剂SPGA摇匀，取样做收获前无菌检验，进行活细胞计数后补加稳定剂SPGA，使活病毒含量达到4×10⁶PFU/ml以上，无菌进行超声波裂解，裂解时间为1min；

5)分装：

取裂解完后过滤，分装小瓶每支1ml，冻干后即得III型火鸡疱疹病毒疫苗成品。

优选地，本发明的方法中，所述火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒HVT Fc126株病毒。

优选地，本发明的方法中，所述步骤1)的鸡胚成纤维细胞悬液培养时间为培养24h。

优选地，本发明的方法中，所述步骤2)和步骤4)的血清为血清I型、血清II或血清III。

优选地，本发明的方法中，在步骤5中还包括冻干步骤，即冻干保存或加入冷冻保护液，定量分装，液氮保存。

优选地，本发明的方法中，所述冻干步骤为：使用III型火鸡疱疹病毒疫苗成品，在-40℃入箱预冻，3～5h后进入干燥阶段，逐渐升高制品直至达到设定值后，保温2～4h，压塞出箱，-15℃以下保存，即获得III型火鸡疱疹病毒疫苗冻干苗。

优选地，本发明的方法在使用细胞工厂后，为了连续生产的需要，还包括细胞工厂清洗过程：即用灭菌超纯水反复清洗用过的细胞工厂3～5次，包装好，进行钴源照射消毒后以备重复使用。

由上可以看出，本发明使用细胞工厂生产火鸡疱疹病毒疫苗的方法，与现有技术中使用转瓶或摇瓶培养的方法相比，至少有以下优点：