[发明专利]高敏感的内切核酸酶的生产方法、内切核酸酶的新制品及其用途

说明书

本申请是申请日为2005年7月29日、申请号为200580031302.4(PCT/EP2005/009220)的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及鉴定和制备具有高活性和敏感性以及宽底物特异性的错配特异的内切核酸酶。

背景技术

上个世纪初，对通过辐射或化学品在DNA内部诱导突变的可能性的发现已经为理解活体内基因功能带来了相当大的希望。自那时起，诱变作用和自然序列变化已经被广泛地用于鉴定新功能、对应于特异功能的基因以及一个特异蛋白质内部的活性位点。

实施这个方法的一个关键方面，特别是在点突变的情况下，是对突变检测方法的选择，这些方法被设计为对大段的DNA进行筛选而不减少诊断敏感性或特异性，并且同时能提供有关突变位点的信息。最常用的工具当中有基于不完全配对的DNA的方法，该DNA能够通过两个DNA分子的变性和复性在试管内产生。使用如沟结合剂等化学品或能够在错配位点上特异地剪切单链DNA的分子在这些异源双链分子中检测到错配。可替代地，单链特异的内切核酸酶已经被用于在错配位点剪切DNA。目前已被描述的绝大多数内切核酸酶属于S1/P1类核酸酶。

例如S1、P1和绿豆核酸酶等核酸酶，属于被命名为：“S1/P1族核酸酶”或为：“S1族核酸酶”的同一族，已知能用于在单链区域切开DNA。但是这些核酸酶所具有的酸性pH最佳值是在4.0-5.0的范围内。

这对于错配检测是不利的，因为低pH值有利于DNA脱嘌呤并且使得DNA双链体不稳定，导致非特异的DNA降解，并且降低检测的敏感性和特异性。

几年前，OLEYKOWSKI等人(Nucleic Acids Res，26，4597-4602，1998)从不同的植物提取物中检测到一个错配内切核酸酶的活性，其具有中性的pH最佳值(大约pH 8)并在错配位点的3’端完成一个单链切开。这些作者报道了该错配内切核酸酶的活性与苜蓿芽、芦笋、芹菜和西红柿的提取物中的甘露糖基糖蛋白(mannosyl glycoproteins)有关。芹菜中的酶，称之为CEL I，是通过连续的硫酸铵沉淀步骤从芹菜茎中提纯，结合到一个刀豆体球蛋白A-琼脂糖柱并且被[α]-d+-甘露糖洗提，结合到一个磷酸纤维素柱并且被线性梯度的KCl洗提，并且用尺寸排阻色谱法分级分离。因此获得的CEL I制品包含几个34-39KDa的蛋白带。

YANG等人(Biochemistry，39，3533-3541，2000)和PCT申请WO 01/62974描述了一种改进的CEL I提纯，它是通过在提纯缓冲液中使用α-甲基甘露糖苷来克服CEL I与内源性选择素的聚集反应。这些文件还披露了CEL I cDNA的克隆。以序列数据为基础，CEL I被指定为S1/P1族核酸酶的一个亚族，并且鉴定出几个用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的BFN1(GenBank核苷酸(nucleotide)AY040016)、百日草属植物的ZEN1(GenBank核苷酸AB003131)和萱草的DSA6(GenBank核苷酸AF082031)的基因进行编码的可能的同系物。

CEL I内切核酸酶活性已经显示出对于碱基替换的错配以及由于插入/缺失情况引起的错配是高度特异的，并且独立于侧翼序列环境。因此它在包括突变筛选等不同的方法中作为突变检测试剂是很有用的。CEL I错配检测系统是一个简单的测定法，它需要靶序列的聚合酶链反应扩增(PCR扩增)、变性和退火，以允许在野生型和突变体等位基因之间生成异源双链体，酶的错配剪切，以及通过凝胶电泳法的产品分析。因为它在对大段DNA中的错配进行检测时的特异性和敏感性，它比其他流行的错配检测系统有利，比如变性HPLC。