[发明专利]一种改进的人延长因子1α启动子

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于指导哺乳动物来源蛋白质在哺乳动物细胞中表达的人延长因子1α启动子(hEF-1α)及其应用。

背景技术

启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因(gene)的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸(nucleotides)，那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录(transcription)因子的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases)的活动。这种酶指导着RNA复制。基因的启动子部分发生改变(突变)，则会导致基因表达的调节障碍，这种变化常见于恶性肿瘤。

由于真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子II最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：(1)有多种元件：TATA框，GC框，CAAT框，OCT等；(2)结构不恒定。有的有多种框盒如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白，(3)它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，(4)有的有远距离的调控元件存在，如增强子；(5)这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；(6)不直接和RNA pol结合。转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。

启动子位于结构基因5’端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。全酶是指酶蛋白及其辅酶构成的有功能的复合物。

Hogness等在真核基因中发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30bp处的TATAAAAG，称TATA框(TATAbox)。另外在转录起始位点上游70～80bp处还有一段共同序列GCCTCAATCT，称为CAAT框(CAAT box)。起始子和TATA框是启动子的核心元件。在真核基因中，有少数基因没有TATA框。没有TATA框的真核基因启动子序列中，有的富集GC，即有GC框；有的则没有GC框。TATA框的主要作用是使转录精确地起始；CAAT框和GC框则主要是控制转录起始的频率，特别是CAAT框对转录起始频率的作用更大。

启动子中的-10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序。但是附近其他DNA顺序也能影响启动子的功能。例如，在核糖体RNA合成的起始位点的上游50到150核苷酸之间的顺序就是对启动子的完全活性所必需的。如果这一段DNA顺序缺失并由其他外来DNA所取代(例如克隆在质粒DNA中的rRNA基因)，则转录起始的频率将降低10倍。同样，在其他情况下，远隔部位的富有AT的DNA顺序被认为能增进转录起始的频率。有时候上游顺序可以是某些能直接激活RNA聚合酶的″激活蛋白″的结合部位。但是，上游顺序往往有另外的功能。例如上游顺序可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。上游顺序所引起的DNA结构的微细变化可能在双螺旋上被传导到相当远的距离，因此上游顺序的变化可以影响到-10和-35区的DNA结构细节。

在外源蛋白的表达中，启动子起着至关重要的地位。合适的强启动子可以将其表达量成倍提高，无论对于工业生产还是科学研究，其意义都是非常深远的。

发明内容

本发明目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种可以指导外源哺乳动物细胞蛋白高效表达的改进的EF-1α启动子及其应用，以降低哺乳动物来源蛋白的生产成本。

本发明通过在EF-1α启动子转录起始点上游不同位置添加CAAT框的方式，筛出了一条表达水平较高的启动子。

本发明一方面提供了一种改进的人延长因子1α启动子(hEF-1α)，为在人EF-1α启动子序列的第105与106位碱基间插入了序列为GGCCAATCT(CAAT框)的多核苷酸片段。

所述人EF-1α启动子序列为SEQ ID NO：10。

进一步的，所述的改进启动子的序列为SEQ ID NO：1。

本发明所述的启动子是由pEF6/V5-HisA载体的hEF-1α启动子改进获得。

本发明第二方面提供了所述改进的启动子在哺乳动物来源的蛋白或多肽的细胞表达中的应用。

具体的，可用于在哺乳动物宿主细胞中指导哺乳动物来源蛋白的高效表达。