[发明专利]蜂蜜基因的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及蜂蜜基因的提取方法。

 

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜中含有多种糖，主要是果糖和葡萄糖。此外，还含有有机酸、酶和固体颗粒物如植物花粉等。由于蜂蜜市价较高，市场需求量大，有一些不法商贩以假乱真、以次充好，严重地损害了消费者利益，因此急需建立蜂蜜产品的鉴别评价体系。

虽然蜂蜜产品从外观、口感等方面难以区分，但是蜂蜜DNA与蜜源植物有关，这是无法伪造的，因此，基因检测手段在蜂蜜的质量控制方面显得尤为重要。目前国内外常用的种属成分检测方法，主要是以核酸为基础的聚合酶链式反应检测方法，简称PCR法。PCR法一般要求模板DNA的浓度达到20 ng/μl以上，纯度采用OD₂₆₀/OD₂₈₀比值来表示，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值需在1.7~2.0之间。由于蜂蜜所含成分复杂，DNA较难提取，这在一定程度上限制了蜂蜜PCR检测方法的开展。

目前常用的DNA提取方法主要有高盐低pH法、苯酚法和CTAB法。

其中高盐低pH法主要用于植物组织DNA的提取。低pH有利于防止植物中的多酚类物质氧化，高盐则是有利于蛋白质沉淀。本实验尝试将高盐低pH法应用于蜂蜜DNA的提取中，经测定，采用高盐低pH法提取的洋槐蜂蜜DNA的浓度与纯度较低，DNA的浓度为13ng/μl，OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.25，难以满足PCR反应的要求。经分析，高盐低pH法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是与一般植物组织相比，蜂蜜样品中的DNA含量较少，采用高盐低pH法难以达到富集纯化蜂蜜DNA的目的。

苯酚法是采用裂解液将DNA释放出来，然后交替用苯酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂进行抽提，去除溶液中的蛋白质。苯酚、氯仿去蛋白质的能力较强而去多糖的能力较弱，适用于动物组织DNA的提取。本实验尝试将苯酚法应用于蜂蜜DNA提取中，样品经过苯酚及氯仿溶液的多次抽提后，所获得的DNA的质量较低，DNA的浓度为11ng/μl，OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.43，难以满足PCR反应的要求。苯酚法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是蜂蜜样品中的DNA含量低，在苯酚及氯仿溶液的多次抽提反应中损失较大，导致最终获得的DNA含量偏低，DNA质量达不到下一步PCR检测的要求。

CTAB法因为能较好地去除多糖杂质，故常用于植物组织DNA的提取。CTAB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂。CTAB既可以裂解细胞膜，使核酸释放出来，又可在不同的盐离子浓度下选择性地沉淀多糖或者核酸，从而达到纯化DNA的目的。本方法尝试将常规CTAB法直接应用于蜂蜜DNA的提取中，所得蜂蜜DNA的浓度为16ng/μl，OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.39，不能满足后续PCR检测的需求。常规CTAB法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是蜂蜜成分复杂，特别是多糖及蛋白含量高，应用常规CTAB法无法有效去除多糖以及蛋白杂质，影响了蜂蜜DNA的得率以及纯度。

由于蜂蜜成分复杂，其中大约75%的成分为糖类，同时还含有多种酶、氨基酸、无机盐等，常规的CTAB法也无法提取获得高浓度与高纯度的蜂蜜DNA。所以必须改进，寻找能提取高浓度与高纯度蜂蜜DNA的方法，以满足PCR检测的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种从蜂蜜中提取基因的方法。

本发明的技术方案采用：蜂蜜基因的提取方法，按以下步骤顺序进行：

（1）取10 mL以上蜂蜜，加入等体积的pH为7.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液，振荡1~3小时，充分混匀后离心，弃去上清液，加入3 mL pH为7.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，离心，弃去上清液，保留沉淀物；

（2）加入1 mL裂解缓冲液于沉淀物中，充分悬浮，混匀，加入10 μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，混匀，置65 ℃水浴加热45~60 min，不时摇动；所述的裂解缓冲液是十六烷基三甲基溴化铵、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和氯化钠的混合水溶液，其中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为50mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为2mmol/L，氯化钠的浓度为400mmol/L，用盐酸调pH至8.0；