[发明专利]一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺DEN诱发大鼠肝癌模型建立的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺DEN诱发大鼠肝癌模型建立的方法。 

背景技术

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，有“癌王”之称。因此需要选择一种合适的肝癌动物模型来模拟人体肝癌的病变过程帮助肝癌的研究。 诱发性肝癌模型是指用化学、物理或生物的致癌因素作用于动物而形成的肝癌模型。其中，二乙基亚硝胺（DEN）是动物肝癌是一种广泛应用的诱发剂，它诱发的肝癌过程与人体癌症演变过程非常相似。目前DEN已被国际肿瘤研究中心机构确定的致癌物质。微囊藻毒素MC是一种肝毒素，生物毒性作用的靶器官为肝脏。可从血液中转移到肝脏，主要表现为使肝脏充血肿大，严重时可导致肝出血和坏死。

大鼠肝癌模型的建立方法分为移植型和原发性两种，移植型肝癌模型通常是将肝癌细胞注射到小鼠腹腔，抽取腹水后分离成细胞悬液，再打开小鼠腹腔并将细胞悬液注射到小鼠肝脏建立模型。该模型成瘤时间较短，但无法观察到肝癌发生的过程。原发性肝癌模型是利用化学致癌物质诱发大鼠肝癌缓慢发生，这种模型虽然时间较长，但可以观察到肝癌发生发展的主要阶段，有利于肝癌早期瘤前病变的检测。目前国内外有很多用DEN诱发原发性大鼠肝癌的模型，一般采用0.25％DEN水溶液灌胃或自由饮水的方法建立大鼠肝癌模型。该模型主要存在的问题是染毒剂量不准确，时间较长，如李笑岩等人用含二乙基亚硝胺(DEN，80×10^-6)饮水建立大鼠肝癌模型，其模型1-8周为肝细胞损伤期，9-16周为增生-硬化期，17-25周为癌变期。而赵金明等以二乙基亚硝胺为启动剂，藻毒素为促进剂，构建大鼠肿瘤促进模型，观察肝脏病理形态改变，分别运用免疫组化法、原位杂交法检测肝细胞中GST-Pi 蛋白和GST-Pi mRNA表达情况。结果显示实验组动物肝脏产生结节性增生灶，藻毒素单独作用不能诱导GST-Pi 蛋白和GST-Pi mRNA表达，但能够促进DEN诱导产生的GST-Pi mRNA 及蛋白表达。提示藻毒素具有促癌活性,但所用的藻毒素是从水华蓝藻中的初提物，并没有藻毒素纯度及类别鉴定的数据，而藻毒素有60多种，不同时间、地点所收集的水体藻样所中藻毒素的含量及类别是有差异的，这些增加了实验结果的不确定性。另外，所用的藻毒素剂量为20mg/kg.bw(高剂量)、5mg/kg.bw(低剂量)(相当于干藻细胞质量)，并没有进行系列浓度实验。

藻毒素专一性地作用于肝脏，主要抑制蛋白磷酸酶PP1、PP2的活性,具有明显的剂量-效应关系：低剂量的藻毒素有促细胞生长作用，而高剂量可以诱导细胞凋亡，抑制细胞生长。因此，确定藻毒素类型及作用浓度范围对于促癌模型的建立显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是通过慢性毒理实验，在低浓度下建立藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌模型，在这个过程中可以通过形态学、组织病理学和蛋白表达水平观察到肝癌形成的主要阶段，包括肝细胞损伤期，肝细胞增生-肝硬化期以及肝细胞癌变期。

本发明的技术方案如下：

一种微囊藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌模型的建立方法，步骤为：

1.大鼠肝癌模型的建立

A、选取体重为150±5g的SD雄性大鼠15只，给予一周的适应时间，饲养期间给予充足的食物，并做好各项消毒措施；

B、用纯水将DEN配成浓度为0.25%的溶液；

C、用无水甲醇将藻毒素纯品粉末溶解，配制成1mg/ml的藻毒素溶液；

D 、将0.25%的DEN溶液和1mg/ml的藻毒素溶液注射到大鼠腹腔内，使DEN终浓度为10mg/kg,藻毒素终浓度为10μg/kg；

E 、上述过程每五天进行一次，共处理4个月；

F、模型建立过程中始终观察大鼠的食欲，饮水，皮毛，精神等情况；

2．形态学检测 

在每个月末以颈椎脱臼法处死大鼠，打开腹腔，完整地取出肝脏后用PBS缓冲液清洗，记录体重、肝重并计算肝重体重比及观察肝脏的颜色和质地，并拍照；

3.组织病理学检测 

取部分肝叶经10％中性甲醛溶液固定24h，石蜡包埋，切片后经HE染色，显微镜下观察细胞的变化；

4.GST-Pi蛋白表达含量检测