[发明专利]定量检测玉米赤霉烯酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物检测技术领域的方法，具体是涉及一种定量检测玉米赤霉烯酮的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone，ZEN)是镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物。玉米赤霉烯酮毒素可存在于玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦等谷物，也可存在于食用含ZEN饲料的动物组织中，包括牛奶、鸡蛋等。玉米赤霉烯酮毒素与自发性乳腺癌，输卵管和子宫水肿、增生，精细胞畸变、凋亡等疾病有关。玉米赤霉烯酮毒素具有分布广泛、残留时间长、难处理、和其他毒素一起有增强毒性的现象。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种快速简便的玉米赤霉烯酮毒素检测方法。

胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用抗原抗体反应的一种免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl₄)在还原剂如白磷、单宁酸/柠檬酸钠和柠檬酸三钠等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团因静电作用而形成牢固结合。这种球型的胶体金颗粒具有高电子密度，能够对多种生物高分子物质如葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、BSA(牛血清白蛋白)等非共价结合，形成可见的紫红色，使其成为免疫反应的优良标记物，因此广泛应用于各种物质的检测。

酶联免疫吸附实验由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应，需较长时间，各个步骤需彻底地洗涤，并且需要特定的酶和底物显色，因此耗时长，程序繁琐；高效液相色谱法因其对检测样品、仪器及操作人员的要求，不利于基层常规检测使用。胶体金免疫层析法能克服上述方法的不足，胶体金免疫层析定量试验法利用抗原抗体反应原理，胶体金标记示踪物与固定在膜上的抗原或抗体形成复合物被截留而显色，不需要特定的酶和底物显色，也不需要抗原抗体之间的较长时间的物理吸附，而根据显色深浅判定阴阳性结果并根据标准曲线计算出具体浓度，安全有效，简单方便。

胶体金免疫层析试验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的胶体金标记。固定在NC膜上的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，胶体金标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又有示踪的功能。在测定时，受检样品(测定其中的抗体或抗原)通过毛细作用向前移行与金标垫上的抗原或抗体起反应。继续向前移行，与固定在T线(检测线)抗原或抗体结合形成免疫复合物被截留而显色，约为一条宽为1mm的棕红色条带，多余的金标抗体继续向前移动，与固定在C线(质控线)的二抗结合被截留而显色，约为一条宽为1mm的棕红色条带。此时T线形成金标复合物与标本中受检物质的量呈一定的比例，故可根据T线呈现的颜色深浅进行定量分析。

关于玉米赤霉烯酮毒素的检测国内外已建立了多种方法。目前检测ZEN的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，液谱和质谱联用法(LC-MS)。然而，这些方法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速定量检测玉米赤霉烯酮毒素的方法。本发明检测对象单一且针对性强，准确率高，检测速度快，所需时间短，只需20分钟，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足粮食储存销售机构、出入境、海关等检验部门快速、正确地判断ZEN含量的要求，并且便于基层推广和运用。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种检测玉米赤霉烯酮的方法，该方法包括如下步骤：

步骤一，将ZEN半抗原分别与BSA和OVA偶联，得到偶联物ZEN-BSA和ZEN-OVA；

步骤二，用ZEN-OVA作为免疫原，采用常规方法制备抗ZEN的单克隆抗体；

步骤三，制备胶体金，用该胶体金标记抗ZEN的单克隆抗体，将标记后的单克隆抗体喷涂到金标垫上；

步骤四，在硝酸纤维素膜上进行ZEN-BSA、兔抗鼠抗体的喷涂，之后将所述喷涂后的硝酸纤维素膜放入牛血清白蛋白溶液中封闭；

步骤五，将所述金标垫、所述喷涂后的硝酸纤维素膜、样品垫和吸水垫组装成试纸条，干燥；

步骤六，根据已知不同浓度ZEN标准品的显色值，绘制ZEN浓度与显色值的标准曲线；