[发明专利]一种重组酶基因、双元表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组酶，其特征在于：它为ntCre基因，其具有如SEQ ID No.1序列。

2.如权利要求1所述重组酶的制备方法，其特征在于：

用引物SEQ ID.4和引物SEQ ID.NO.5、PrimStar HS DNA聚合酶从大肠杆菌菌株BM25.8基因组DNA中PCR扩增出1040 bp大小的源自P1噬菌体的Cre基因(GenBank accession X03453），反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性10 sec，50℃退火20 sec，72℃延伸1 min 10 sec，3个循环，95℃变性10 sec，60℃退火20 sec，72℃延伸1 min 10 sec，27个循环，最后72℃延伸10 min；用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pMD18-T，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID.NO.6和SEQ ID.NO.7，PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性20 sec，52℃退火20 sec，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min，电泳检测得到预期898 bp大小的产物，测序结果显示所克隆的基因同GenBank中公布的序列，得到阳性克隆载体pVCT1251和重组酶Cre基因；用Xba I和Nco I酶切载体pVCT1251，回收3727 bp片段，弃11 bp片段；

将合成的序列SEQ ID.NO.8和合成的序列SEQ ID.NO.9于94℃变性3分钟后退火，构成含有拟南芥At4g01735基因内含子和猴SV40病毒外壳蛋白T抗原核定位信号的编码序列的Xba I-Nco I接头；将回收片段与接头用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID.NO.10和SEQ ID.NO.11， PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性20 sec，55℃退火20 sec，72℃延伸30 sec，35个循环，最后72℃延伸10 min，电泳检测得到293 bp预期大小产物，得到阳性克隆载体pVCT1252，使重组酶Cre基因上游带上第一内含子和具有核定位信号编码的序列；

用Xba I和Sac I酶切载体pVCT2027，回收3106 bp片段，弃1889 bp片段；

用Xba I和Sac I酶切载体pVCT1252，回收1096 bp片段，弃17 bp和 2669 bp片段；将两个片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用分别位于热激启动子HSP70m上游的LacZ上和位于Cre基因下游的引物SEQ ID.NO.5进行PCR扩增筛选,得1315 bp预期大小产物，再经酶切和测序鉴定，得到阳性克隆载体pVCT2136；

用EcoRV酶切载体pVCT2136，电泳回收4196 bp片段；采用PCR方法，用引物5’-gtaaatttctagtttttctccttc-3’ (位于内含子上游)和引物5’-ctgtaactatcatcatcatcatag-3’ (位于内含子下游)、PrimStar HS DNA聚合酶（TaKaRa，日本）从pCAMBIA1301载体DNA中扩增出190 bp大小的内含子序列，并电泳回收；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用分别位于Cre基因两端的引物SEQ NO.4和SEQ ID.NO.5(位于ntCre基因下游)进行PCR扩增鉴定和测序验证，得到阳性克隆载体pVCT2117和预期的ntCre基因。

3.含权利要求1所述重组酶的植物双元表达载体，其特征在于：所述植物双元表达载体的T-DNA结构包括RD29A::ntCre::Tnos基因和LoxP序列；其中RD29A为重组酶ntCre的低温诱导特异性启动子，LoxP为重组酶ntCre的识别位点、切割和重组的序列。

4.如权利要求3所述的植物双元表达载体，其特征在于：所述的植物双元表达载体为pVCT2221，其T-DNA结构的主要构建元件包括：LB、T35s、LoxP、nptIIm、Pnos、Tnos、ntCre、RD29A、35S、mGFP和RB序列。