[发明专利]一种重组酶基因、双元表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组酶基因、双元表达载体及其构建方法和应用，尤其涉及一种重组酶ntCre基因和低温诱导删除选择标记基因的植物基因双元表达载体和相关的构建方法及其在转化烟草中的应用。

背景技术

在植物转基因过程中，为了将转基因细胞和非转基因细胞分开，常常会引入一个选择标记基因，而选择标记基因编码的蛋白可以使植物细胞拥有抵抗抗生素的能力，从而使得转基因细胞在有抗生素的环境中存活下来。由于选择标记基因已经整合到了植物的基因组中，抗性基因可能会在新的生态环境中发生水平转移（基因漂移）和垂直遗传，其潜在的危害性并没有完全探知。同时，转基因植株一旦获得，选择标记基因就没有继续存在的必要。因此，可以或应该用适当的生物技术手段将它们予以淘汰除去。无抗性标记基因的转基因植物不仅可促进转基因技术的发展，而且可排除由之带来的潜在的生物安全问题。

根据重组酶基因引入方式，利用位点特异重组介导的标记基因删除技术获得上述无选择标记基因的转基因植株有以下两种方法：

第一，间接引入重组酶法，即通过有性杂交或二次转化的方式将重组酶基因引入已获得的转基因植物基因组中，使该转基因植株中位于两个同向重组酶识别位点之间的选择标记基因被删除。有性杂交引入法就是用含有重组酶基因和含有目标基因以及相同或相异选择标记基因的农杆菌，分别转化同一种植物材料，得到转基因植株父本和母本材料，然后通过杂交，将父本中的重组酶基因引入母本，删除母本材料中两个同向重组酶识别位点之间的选择标记基因，然后通过自交分离，除去源自父本的重组酶基因和选择标记基因，最终得到只含有目标基因的转基因植株。二次转化法是先用含有目标基因和选择标记基因（位于两个重组酶识别位点之间）的农杆菌转化植物，得到转基因植株后，再用含有重组酶基因和另一种标记基因的农杆菌进行二次转化，删除第一次转化得到的转基因植株中的选择标记基因，二次转化得到的转基因植株再通过自交分离，除去源自二次转化的重组酶基因和选择标记基因，得到只含目标基因的转基因植株（Dale E, Ow D W. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome[J]. Proceedings of the National Academy of Science of the USA, 1991, 88: 10558-10562.）。间接引入重组酶法所得到的转基因植株都要通过进一步的自交分离才能得到无选择标记基因的转基因植株，选育过程耗时长，程序繁琐，同时只能局限于有性杂交的植物中，这使得其实用性大大降低。尽管如此，间接引入重组酶法在转基因植物研究中还是占有重要的地位。

第二，直接引入重组酶法是在两个重组酶识别位点之间引入选择标记基因的同时引入重组酶基因。在构建表达载体（expression vector）时，选择标记基因放在两个同向的重组酶识别位点之间，而目标基因放在它们之外，这样在植物细胞中有重组酶基因表达时，两个同向的重组酶识别位点之间的选择标记基因被删除而识别位点之外的目的基因被保留下来。重组酶基因一般被一个可诱导型的启动子所控制。在转化早期，标记基因赋予转基因细胞抗抗生素或除草剂的能力，使其在有选择压力的环境中增殖分化，得到有抗性的转基因植株后，通过一定的条件诱导，使重组酶基因开始表达，在重组酶的作用下，植物体内开始发生位点特异重组反应，从而将选择标记基因删除。