[发明专利]利用DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测L-组氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体是基于DNA序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体的检测L-组氨酸的方法。

背景技术

L-组氨酸，20种天然氨基酸中的一种，它作为一个神经传递介质或神经调质在哺乳动物的中枢神经系统中发挥着重要作用，它也已经被表明在生物的重要基底里支配金属的传输和减小微小创伤的内部流血；足够高剂量的L-组氨酸的摄取能导致中毒症状，因此，生物体液里的L-组氨酸的检测将是非常重要的。

被经常用来分析L-组氨酸水平的方法是毛细管电泳、荧光测定法和比色法。然而这些方法却存在一些不足，包括不稳定的化学和荧光特性、来自于污染的着色剂、荧光团和冷却器的潜在的错误信号以及经常对笨重的光学仪器设备的依赖。

和质谱分析相结合的高性能的液体色谱分析法和气体色谱分析法也已经被应用在L-组氨酸的检测，这些方法经常需要昂贵的机器设施和复杂的操作程序，同时需要生物样品的乏味冗长的前处理过程，因此检测微量L-组氨酸的电化学方法被开发，但是很少描述L-组氨酸的手性分析，到目前为止关于报道的手性分析技术都是建立在色谱法、毛细管区带电泳、质谱分析和电分析基础上的，电分析方法具备相对高的效率和低费用的特征，然而，现有的采用电化学法分析L-组氨酸的方法，存在窄的线性范围和相对高的检测限。

脱氧核酶是具有催化性能的DNA序列，它通过试管内育种分离出来。辅酶依赖型的脱氧核酶能在选择的过程中通过变化的辅酶和变化的辅酶浓度产生。RNA的自断裂活动产生于核糖2’羟(基)氢氧基。当某种阳离子金属出现或者在碱性条件下，这个羟(基)氢氧基形成一个2’阳离子，这个2’阳离子在一个酯交换反应中充当一个亲核试剂，切断RNA链。Roth和Breaker(见参考文献[1]Roth，A.，Breaker，R.R.，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，6027-6031.)报道了一个催化性的DNA的试管内筛选，在RNA链断裂反应中用L-组氨酸作为一个主动的辅酶，动力分析表明，一个DNA-L-组氨酸复合物可能完成反应类似于核糖核酸酶的催化机制的第一步，L-组氨酸的咪唑官能团充当一般的碱性催化剂。

另外纳米金晶体具有独特的表面等离子共振性质，以及卓越的生物兼容性的特点。它在生物传感领域有着巨大的潜在应用前景。但是，以往传统方法合成的纳米金晶体都是以较低的指数面包围，如(100)，(111)，(110)等。众所周知，具有高能指数面的纳米金晶体由于表面具有高密度的原子阶梯而具有极高的化学活性和电催化活性，然而正是由于这些具有高表面能的晶面在晶体合成过程中迅速地消失，以致长期以来，合成高指数面的纳米金晶体具有很大的难度。

发明内容

本发明的目的是克服传统L-组氨酸检验方法的不足，提供一种简单快速、特异性强、重复性好、灵敏度高，可以手性识别L-组氨酸的方法。在本发明中，采用简单方便的湿化学方法合成出具有24个高能指数面的纳米金晶体(拉长二十四面体)，极大地提高了电化学法检测L-组氨酸的灵敏度。本发明中首次提出采用电化学方法来快速检测L-组氨酸，该方法建立在依赖于L-组氨酸的自断裂脱氧核酶上，并且基于具有高能指数面的纳米金晶体的信号放大作用。本发明提供的检测方法，基于L-组氨酸存在和脱氧核酶的自断裂活动来产生传感信号，并通过高能指数面的纳米金晶体的修饰达到信号放大的目的。本发明可以达到很低的检测限(0.1pM)和非常好的选择性，同时可以手性识别L-组氨酸。

本发明提供的L-组氨酸的检测方法，具体包括如下步骤：

第一步：晶种溶液的制备：把NaBH₄溶液倒入含有浓度为0.1M的CTAB和浓度为0.5mM的HAuCl₄的溶液中剧烈搅拌，溶液的颜色由黄色变为深棕色，表明金颗粒的形成，之后，晶种溶液静置1小时以备后用；

第二步：生长液的制备：把CTAB粉末溶解在浓度为0.01M的DDAB溶液中配制成双表面活性剂溶液，并且使双表面活性剂溶液中CTAB和DDAB的摩尔比为4；在该双表面活性剂溶液中，依次加入：浓度为1mM的HAuCl₄溶液，浓度为0.01M的AgNO₃溶液，浓度为0.5MH₂SO₄溶液和浓度为0.1M的丙烯酸溶液制备出生长液，该生长液的pH值为2.7；如果DDAB溶液的体积为V，则加入双表面活性剂溶液中的各溶液体积分别为：V、0.02V、0.008V和0.016V；