[发明专利]一种人白血病细胞胞质体的制备及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人白血病细胞胞质体的制备及鉴定方法。

背景技术

细胞质在细胞分化过程中起着决定作用，胞质体（Cytoplast）即去核细胞，是研究线粒体DNA、细胞质膜成分及功能、细胞凋亡、细胞分化等很好的生物模型，也是通过细胞核与细胞质替换实现细胞重构的必备要件。胞质体的制备方法分为侵入性脱核和非侵入性脱核两种，前者是采用显微操作机械去核，适用于体积较大的细胞；后者是在细胞松弛素（Cytochalasin B，CB）介导下通过离心脱核，适用于体积较小的细胞。CB介导的脱核技术已普遍用于大量胞质体的制备。但针对体外非贴壁生长细胞胞质体的制备该项技术还有诸如预处理方法、脱核介质、脱核温度、胞质体纯化及鉴定等技术环节有待改进。本发明针对这些技术环节，对体外悬浮生长的人白血病细胞HL-60胞质体的制备进行了优化，为进一步实施人白血病细胞胞质体和成体干细胞核质体的细胞重构，探讨白血病细胞胞质在细胞分化过程中的作用奠定了基础。

人白血病细胞胞质体是研究肿瘤细胞线粒体DNA、细胞质膜成分及功能、代谢变化、物质交换等重要的生物模式；另一方面，通过其胞质体与体细胞核进行细胞重构，对阐明细胞质在细胞分化过程中的分子机制具有重要意义。然而，人白血病细胞体外培养呈非贴壁生长，具有高增殖性，大量瘤细胞处于有丝分裂期，单用CB不易脱核，不能获得高收率的胞质体。

制备高纯度的胞质体是实现大量细胞重构和其它后续研究的必要前提。任何通过CB介导所制备的胞质体都会有未脱核细胞的混杂，为了保证后实验的精准性，胞质体应进一步纯化。但目前未见这方面的介绍。

胞质体的鉴定方法较多，有姬母萨染色、HE染色、Hoechst 33258染色、DAPI染色等，但这些方法存在染色后的胞质体不能用于后续研究，如：姬母萨染色、HE染色，或不能直接染色胞质体，如：Hoechst 33258染色、DAPI染色。

基于上述人白血病细胞胞质体的制备及鉴定存在的问题，本发明提供一种人白血病细胞胞质体的制备及鉴定方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是：现有人白血病细胞胞质体的制备及鉴定存在的胞质体收率不高，染色后的胞质体不能用于后续研究或不能直接染色胞质体等问题，本发明是提供一种人白血病细胞胞质体制备方法和鉴定方法。

本发明采用的技术方案，

本发明的人白血病细胞胞质体的制备方法，包括以下步骤：

第一，取对数生长期人白血病HL-60细胞，离心后去上清，沉淀用培养基悬浮。取Percoll溶液于离心管中，将上述细胞悬液铺于Percoll溶液面，离心去除白膜层，沉淀用无血清DMEM悬浮，得到纯化的HL-60细胞；

第二，将上述纯化的细胞悬液加入细胞松驰素和秋水酰碱，孵育，离心去除上清，留细胞沉淀；

第三，将细胞沉淀再悬浮于含细胞松驰素的Percoll溶液中，加入超速离心管中配平，转子提前预热至34℃，水平离心吸弃上清，收集Percoll液面上的部分，加入预冷的DMEM混匀，离心去除上清，沉淀用DMEM悬浮，再离心去除上清，沉淀用DMEM悬浮，得到胞质体悬液；

第四，将上述的胞质体悬液铺于Percoll液面上，水平离心吸取白膜层，加入DMEM混合，离心除去上清，用DMEM悬浮，得到人白血病细胞胞质体。

本发明的人白血病细胞胞质体的鉴定方法，采用荧光双染色鉴定人白血病细胞胞质体：向胞质体悬液中加4,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐储存液,再加入羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯储存液，混匀，避光孵育，离心去上清；再加入PBS悬浮，离心去上清，此步骤再重复二次，适量PBS悬浮沉淀，将液体移入24孔板，沉降，用荧光显微镜观察结果。