[发明专利]一种微生物总基因组DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于环境科学和生物技术科学领域，具体地涉及一种微生物总基因组DNA的简易提取方法，该方法借助于生物技术手段，获取样品中微生物基因组。

背景技术

环境样品由于其成分的复杂性在对其进行DNA提取时，想要得到量大，纯度又高的DNA是比较困难的。相对于环境水样中微生物DNA的提取，养殖池塘底泥中微生物DNA提取难度更大。一方面，养殖池塘底泥中微生物种类更为丰富，这就提高了在DNA提取过程中对裂解细胞壁的要求；另一方面，底泥中富含的悬浮物，腐殖质和硫化物等物质，都会影响到所提取到的DNA的纯度，进而影响后续的PCR等实验操作。所以，使环境样品中微生物细胞壁充分裂解释放DNA以及获得纯度较高的DNA样品是养殖池塘底泥微生物总基因组DNA提取和对底泥微生物多样性分析的关键。

本发明解决了养殖池塘底泥微生物总基因组DNA提取中存在的操作时间长，所提取的DNA量少而纯度低等问题，提出了一种微生物总基因组DNA的提取方法，具有DNA释放量大、实验条件简易、成本低等有益效果。

发明内容

本发明提出了一种微生物总基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

（1）将TENP洗液加入待提取样品中，再经过8000rpm，4℃，离心得到沉淀；

（2）向所述沉淀加入裂解液和溶菌酶溶液，于37℃进行水浴后，充分涡旋震荡；

（3）加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，依次于55℃、70℃下进行水浴，于17000g，4℃，离心得上清；

（4）用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提液对所述步骤（3）得到的上清进行抽提，经离心得上清，重复用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提液抽提一次；

（5）用等体积的氯仿/异戊醇抽提液抽提，离心得上清；

（6）向所述步骤（5）得到的上清中加入异丙醇，室温下静置，离心得到DNA沉淀；

（7）用乙醇将所述DNA沉淀重悬，离心后弃上清，经干燥得到沉淀；

（8）用成分为10mM Tris-HCl，1mM  EDTA，PH=8.0的TE溶液将所述步骤（7）得到的沉淀溶解，得到所述微生物总基因组DNA，置于-20℃保存备用。

当所述待提取样品是含有水分的，所述步骤（2）中进行水浴前还加入玻璃珠，并对待提取样品进行充分涡旋震荡处理。

所述的步骤（1）中TENP洗液pH为8~10，添加量为1.5~3mL，优选添加量为2mL。

 所述TENP洗液成分为50 m mol/L Tris，20 m mol/L EDTA，l00 m mol/L NaCl，0.5%~2.5%w/v聚乙烯基吡咯烷酮。其中，聚乙烯基吡咯烷酮的优选添加量为1%w/v。

所述的步骤（2）中，所述裂解液成分为1M Tris-HCl，0.5M EDTA，0.5M Na₃PO4，1.5M NaCl，1% CTAB；所述溶菌酶溶液添加量为200~400μL，浓度为10-80mg/mL。

所述的步骤（3）中，SDS溶液浓度为20%~25%w/v，添加量为100~200μL；蛋白酶K浓度为15-30mg/mL，添加量为50~100μL。

所述的步骤（4）中酚/氯仿/异戊醇抽提液中酚、氯仿、异戊醇的体积比例为25:24:1。

所述的步骤（5）中氯仿/异戊醇抽提液中氯仿、异戊醇的体积比例为24:1。

所述的步骤（6）中所述异丙醇的加入体积是步骤（5）得到的上清体积的0.6倍。

所述的步骤（7）中所述乙醇为预冷的70%乙醇，添加量为1~1.5mL。

本发明目的之一在于解决养殖池塘底泥微生物总基因组DNA提取过程中操作时间长，试剂价格昂贵以及提取到的DNA量少、纯度不够等问题。该方法可以很好的破裂革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的细胞壁，大量除去样品中的腐殖质和蛋白质，所得的DNA可以用于PCR-DGGE技术，能较准确地反映出底泥环境中细菌微生物的丰度和种群多样性。

本发明将采集到的样品先用洗液洗涤，然后经过玻璃珠，裂解液和溶菌酶的作用，使细菌细胞充分破裂，释放DNA。将获得的粗提DNA经过酚/氯仿/异戊醇抽提后得到纯化。按照本发明得到的DNA样品纯度较高，可直接用于后续的PCR等实验操作，且本发明操作简单，耗时短，一次可处理多个样品，非常适合在实验室条件下进行简单的DNA提取。

针对养殖池塘底泥类样品中微生物总基因组DNA的提取，本发明具体操作步骤如下：