[发明专利]热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法

权利要求书

1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于：由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQ ID No：1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQ ID No：2、SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所示的氨基酸残基序列，SEQ ID No：2、SEQ ID No：3和SEQ ID No：4均由317个氨基酸组成。

2.根据权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆

对南极假丝酵母脂肪酶B基因通过上游引物和下游引物扩增目的基因；

上游引物：5’-AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’，带下划线碱其为限制性内切酶NcoI识别位点；

下游引物：5’-TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’，带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点；

以Takara的PrimeSTAR为聚合酶，在上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物；DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET22b(Novagen)进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pET22b-CALB；

B、南极假丝酵母脂肪酶B的结构分析及热点确定

对南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构进行分析(ID：1TCA)，脂肪酶的催化三联体为：自N端起第104位的丝氨酸、第187位的天冬氨酸和第224位的组氨酸，选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子的分析，确定下列B因子较高的残基作为饱和突变的热点：自N端起第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸；

C、南极假丝酵母脂肪酶B突变体库的建立及突变体的筛选

C1、根据热点构建饱和突变体库并导入宿主细胞

以重组质粒pET22b-CALB作为模板，针对步骤B中确定的热点，分别在与第278位亮氨酸、第285位缬氨酸、第277位亮氨酸、第281位甘氨酸和第223位天冬氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，并进行全质粒PCR反应，构建5个定点饱和突变PCR扩增产物，反应结束后，DpnI消化模板，回收，纯化后的PCR产物直接电击导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，将转化后的大肠杆菌直接涂布于含有100ug/ml氨苄和含有2％(v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37℃下培养16-24小时，得到针对5个热点的饱和突变体库；

C2、从饱和突变体库中筛选热稳定性提高的突变体

将步骤C 1中37℃培养后的LB抗性平板在4℃下放置1天，进行初步筛选，将产生透明圈的菌落，接种于含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，于37℃过夜培养，得到分属5个突变体库的母板；

从培养好的母板中吸取20ul液体至新的含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，37℃培养3h，4℃放置30min，再加入终浓度为1mM的IPTG，15℃培养24h；

利用冻融破碎的方法裂解菌体，得到粗酶液；将所得到的粗酶液在49℃下孵育15min，再于冰上放置10min，室温放置15min，测定每孔的残余活力；

将从5个突变体库中筛选到的阳性突变体接入5ml小试管中，至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mM，15℃诱导表达，超声破碎后测定粗酶液的T₅₀¹⁵，确定热稳定性最高的突变体，进行测序，至此，完成了第一轮筛选，得到两个热点的优秀突变体，分别是D223G和L278M；

以L278M的基因作为模板，进行迭代饱和突变：针对285位缬氨酸、277位亮氨酸、281位甘氨酸和223位天冬氨酸位点设计饱和突变库，并参考上述步骤进行新一轮的筛选；

经过多轮的迭代饱和突变，获得了三株热稳定性明显提高的菌株，测定脂肪酶核苷酸序列得出三株突变体分别为：Asp223Gly、Leu278Met和Asp223Gly/Leu278Met。