[发明专利]热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法。

背景技术

脂肪酶(Lipase)是一种用途十分广泛的生物催化剂，不仅可催化油脂在水相中的水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯等反应，常被用于洗涤剂添加剂、食品、制药工业、造纸工业和生物能源等方面。其中，南极假丝酵母脂肪酶B是目前最为有效的生物催化剂之一，广泛用于药物的手性拆分及生物柴油的生产(Kirk O，Anderson EM，Karin M(1998)One biocatalyst-many applications：The use of Candida antarctica b-lipase in organic synthesis.Biocatal Biotransform 16(3)：181-204)。但是工业生产所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾，长久以来一直在制约着脂肪酶的发展和应用。如为了保证催化效率，许多反应需要在较高温度下进行，而南极假丝酵母脂肪酶B属于中温脂肪酶，它的热稳定性差不仅限制了其应用范围，而且使酶易于失活，增加了生产成本。因此，获得一株热稳定性提高的脂肪酶具有重要的工业应用价值。

半理性设计是一种结合了理性设计和定向进化两方面优势的方法，其主旨在于构建小而有效的突变库。目前，半理性设计已成功用于改变酶的底物特异性、热稳定性、对映体选择性等，并取得了显著的成绩(Reetz MT，Carballeira JD，Peyralans J，Hobenreich H，Maichele A，Vogel A(2006a)Expanding the substrate scope of enzymes：Combining mutations obtained by casting.Chemistry-a European Journal 12(23)：6031-6038.Reetz MT，D Carballeira J，Vogel A(2006b)Iterative saturation mutagenesis on the basis of b factors as a strategy for increasing protein thermostability.Angewandte Chemie-International Edition 45(46)：7745-7751.Reetz MT，Prasad S，Carballeira JD，Gumulya Y，Bocola M(2010)Iterative saturation mutagenesis accelerates laboratory evolution of enzyme stereoselectivity：Rigorous comparison with traditional methods.J Am Chem Soc 132(26)：9144-9152)。

我们首先利用已知的信息进行分析，找出可能的“热点”，再对这些“热点”进行饱和突变，构建突变文库；然后选择合适的载体和宿主进行表达；最后对文库进行筛选得到性质改变的突变体。再以此突变株作为模板，重复上述过程，直至变体达到所预期的要求。

大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。在前期工作中，发明人已成功将南极假丝酵母脂肪酶B在大肠杆菌中进行了高效表达。本发明以大肠杆菌作为宿主细胞，利用半理性设计的方法，获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法。本发明的脂肪酶突变体已于2011年11月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁名：Escherichia coli。其中，突变体Asp223Gly的保藏编号为CGMCC No.5390，突变体Leu278Met的保藏编号为CGMCC No.5389，突变体Asp223Gly/Leu278Met的保藏编号为CGMCC No.5387，野生型WT的保藏编号为CGMCC No.5388。