[发明专利]一种检测环境中二恶英类物质的方法

权利要求书

1.一种检测环境中二恶英类物质的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞的培养

（a）冻存：在DMEM培养基中加入20%血清和10%DMSO配制成冻存液，将大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞混匀液加入冻存管中，离心后吸出上清，加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存;

（b）复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于37℃水浴融化，离心、吸去上清液，加入10mL含15%胎牛血清的DMEM培养基吹散均匀，置于5％CO₂的恒温箱37℃条件下培养；

（c）传代培养：24h后取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用PBS缓冲液清洗3遍，加入0.05%DMEM胰蛋白酶37℃条件下消化3min，加入含12% 胎牛血清的DMEM培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新的12% 胎牛血清的DMEM培养基，于含5％CO₂的培养箱中37℃条件下培养；

2）环境中二恶英类物质的检测

（a）接种：取步骤1）得到的生长良好的H4IIE细胞，弃去培养液，加入 DMEM 胰酶消化，倒置显微镜观察消化情况，消化完全后加入新鲜配制的含胎牛血清和双抗的培养液终止消化，滴管轻轻将细胞吹打脱壁，吸至无菌洁净锥形瓶中添加培养基进行细胞浓度调节，混匀后取5μL用血小球计数板计数；按每孔2×10⁵个细胞接种到96孔板，于含5％CO₂的培养箱中37°C条件下培养24h；

（b）上样：取出上述步骤（a）得到的96孔板，弃去培养液。

2.取无菌洁净EP管，每个EP管中先加995μL添加胎牛血清与双抗的DMEM培养液，再加5μL溶于DMSO的待测样品，另取作为溶剂对照的EP管中添加5μL DMSO，涡旋混匀，按照每孔100μL添加于96孔板中，在CO₂培养箱中暴露72h；

（c）反应：取出上述步骤（b）得到的96孔板，弃去溶液，加入100μL 新鲜配制的含1μL 1mM的ERF和0.1μL 10mM 的双香豆素的DMEM培养液，置于CO₂培养箱中反应60min，60min后加入130μL甲醇终止反应，室温下于96孔板摇床混匀；

（d）用酶标仪测反应液的荧光强度:移液器吸取100μLRF溶液于酶标板中，激发波长535nm，吸收波长590nm，测荧光强度；

(e) 用酶标仪测蛋白吸光值:将上述步骤（d）的96孔板中剩余反应液吸出，加入120μL 0.3M的NaOH破碎细胞10min，细胞破碎后吸出100μL，加入G250染液200μL反应10min，于酶标仪上595nm测蛋白吸光值；

（f）用酶标仪检测步骤（c）的反应液的荧光强度和蛋白蛋吸光值，用5μL 溶于DMSO的不同浓度的2,3,7,8-TCDD 诱导的EROD酶活作出剂量－效应关系标准曲线，将样品的EROD酶活值与上述剂量-效应关系标准曲线对比得到样品的2,3,7,8-TCDD毒性当量。