[发明专利]一种检测环境中二恶英类物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境监测技术领域，具体涉及一种检测环境中二恶英类物质的方法。

背景技术

二恶英类(Dioxins，DXNs)污染物是一类具有相似化学结构、理化性质和生物效应的氯代芳香化合物，包括多氯代二苯并对二恶英(Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins，PCDDs)、多氯代二苯并呋喃(Polychlorinated Dibenzofurans，PCDFs)和类二恶英多氯联苯(dioxin like Polychlorinated Biphenyls，dl-PCBs)。二恶英类化学物质的毒性作用主要是通过与机体细胞内芳香烃受体(arylhydrocarbon receptor，AhR)相结合(poland et al.，1982)，形成的复合物转移入细胞核与芳香烃受体核转位子蛋白(AhR nuclear translocator，Arnt蛋白)结合，形成的DXNs-AhR-Arnt复合物能与二恶英应答元件(Dioxin Response Elements，DRE)结合，诱导特异基因表达(主要是CYP1A1)，导致毒性作用。由于二恶英与芳香烃受体接触的量与其诱导基因表达的能力在一定范围内成正比，因此可通过检测特异基因的表达产物来反映样品中二恶英的毒性当量(Toxic Equivalence，TEQ)。

环境DXNs分析属于超痕量、多组分分析，基质效应复杂，定性定量检测复杂，是现代分析的难点，目前发展起来的检测技术主要包括：色谱法分析测试技术、生物法快速分析测试技术和其他测试技术(Reiner，et al.2006)。检测二恶英类化合物的生物检测法，主要有活体检测法(in vivo)、体外受体结合实验(Receptor binding assay in vitro)和基于离体细胞培养检测法(bioassay in vitro)。其中活体检测法是利用动物活体暴露于待测物质，通过检测体内指标性酶活来进行检测，但该法检测时间较长，造价较为昂贵；受体结合实验是基于二恶英-Ah受体结合并激活其结合DNA的特性，同构检测二恶英-Ah受体复合物或与DNA结合的复合物的量来指针样品的二恶英效应强度，但抗体较难获得；因此，以上两种方法均不适于作为二恶英类污染物的快速筛查技术。而现用的离体生物测试方法测得的结果也不能真实地反映污染物的生物毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测环境中二恶英类物质的方法，该方法快速简便，成本低廉，省时省力，应用广泛，所需样品量少，能够反映环境样品的类二恶英效应，并且通过标准曲线计算得到样品中二恶英类污染物的毒性当量值。

本发明的技术方案是：

环境二恶英类物质能诱导大鼠肝癌细胞株H4IIE产生EROD酶，7-乙氧基-异吩恶唑酮和NADPH在氧气和EROD酶生成7-羟基-异吩恶唑酮(RF)，RF为荧光物质，以大鼠肝癌细胞株H4IIE中EROD酶为生物标记，用2，3，7，8-TCDD诱导的酶活作出剂量-效应关系标准曲线，根据此标准曲线得出待测样品的二恶英当量(TEQ量)。

本发明检测环境中二恶英类物质的方法包括以下步骤：

1)大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞的培养

(a)冻存：在DMEM培养基中加入20％血清和10％DMSO配制成冻存液，将大鼠肝细胞瘤H4IIE细胞混匀液加入冻存管中，离心后吸出上清，加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存；

(b)复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于37℃水浴，手动慢摇恒温2min，复苏后离心、吸去上清液，加入10mL含15％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂的恒温箱37℃条件下培养；

(c)传代培养：取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用PBS缓冲液清洗3遍，加入消化液37℃条件下消化3min，加入含12％胎牛血清的DMEM培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新鲜培养基充分，于含5％CO₂的培养箱中37℃条件下培养；

2)环境中二恶英类物质的检测