[发明专利]β-1,4-内切甘露聚糖酶(Tvi Man5A)基因的克隆及重组酶的制备

权利要求书

1.一种来源于T.viride WL 0422的新型β-甘露聚糖酶基因，其核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.T.viride WL 0422新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆方法：

(1)β-甘露聚糖酶基因3′端mRNA序列的克隆：首先对A.usamii、A.sulphureus和T.reeseiβ-甘露聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列；再对它们的核酸序列进行同源比对，设计两条正向简并引物Man5A-3F1和Man5A-3F2；

Man5A-3F1：5′-GTATGGGGCTTCAACGACGTC-3′

Man5A-3F2：5′-AC(C/A/G)ATCAAC ACGGG(C/T/A)GCCGA-3′

以T.viride WL 0422总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以Man5A-3F1和M13 Primer M4为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃90s)，72℃10min；以Man5A-3F2和M13 PrimerM4为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃90s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Tvi man5A 3′端mRNA序列；

(2)β-甘露聚糖酶基因5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Tvi man5A 3′端mRNA序列，设计两条反向引物Man5A-5R1和Man5A-5R2；

Man5A-5R1：5′GGATGACGAGCTTGAGGTTA-3′

Man5A-5R2：5′-ACTACATAGTCGAGCGTTTG-3′

以合成的cDNA第一条链为模板，5′-Full RACE Kit的Outer Primer和Man5A-5R1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以Inner Primer和Man5A-5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Tvi man5A5′端mRNA序列；

3.T.viride新型β-甘露聚糖酶工程菌的构建和表达方法：

(1)构建含编码Tvi Man5A成熟肽基因的表达质粒：以合成的cDNA第一条链为模板，第一轮PCR以Man5A-F和M13 Primer M4为引物，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min；第二轮PCR以Man5A-F和Man5A-R为引物，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序结果正确的pUCm-T-man5A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组表达质粒pPIC9K-man5A，并对表达质粒进行测序鉴定；

(2)GS115/man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sac I对pPIC9K-man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A；该基因工程菌用1.0％甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵液中重组β-甘露聚糖酶活性达90IU/mL；发酵液经离心后的上清液为重组β-甘露聚糖酶粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10,000Da的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组β-甘露聚糖酶的分子量为50kDa；该重组β-甘露聚糖酶的最适作用温度70℃，最适作用pH 3.5，在pH 3.0-7.0、60℃以下稳定；金属离子Al³⁺、Ca²⁺对酶活性有明显的激活作用，而Ag⁺则具有很强的抑制作用。