[发明专利]β-1,4-内切甘露聚糖酶(Tvi Man5A)基因的克隆及重组酶的制备

说明书

技术领域

本发明涉及来源于绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422的一种新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌的构建，以及重组β-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于微生物基因工程技术领域。 

背景技术

β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78)是一种能从均一甘露聚糖和异甘露聚糖主链的内部降解β-1，4-甘露糖苷键的水解酶，属于半纤维素酶类，其广泛地存在于微生物、植物和动物中。它可以广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、印染和石油工业等领域。在食品和医药领域，β-甘露聚糖酶作用于甘露聚糖后可以产生功能性低聚糖，这种低聚糖可以有效地降低人体血糖和胆固醇水平且有利于人和动物肠道内益生菌群的生长，进而调节人和动物的免疫系统、提高免疫力。在饲料工业中，它作为饲料添加剂能有效降解植物细胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗营养因子，提高能量利用率、改善饲料转化率。在造纸工业中，β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，处理纸浆，能明显改善纸质。将β-甘露聚糖酶运用纺织印染的漂白工艺中，能有效地去除产品上粘附的多余染料，更可以减少氯和碱的用量以及它们带来的环境污染问题，有利于生态环境的保护。另外，在酶法降解可再生生物质资源生产燃料酒精的工艺中添加一定量的β-甘露聚糖酶可以促进可发酵糖的产生，进一步促进燃料酒精的生产，缓解全球的能源危机。目前已报道的能产β-甘露聚糖酶的微生物主要来自于细菌、真菌和放线菌，例如细菌中的枯草芽孢杆菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、酵母，以及放线菌中的链霉菌等。根据序列同源性和空间结构分析，多数β-甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶第5、26和113家族。目前，关于第5家族β-甘露聚糖酶的报道较多，它们的最适pH值为3.0～7.5，最适温度在45～92℃。 

近年来，随着对自然界中半纤维素资源的开发、饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露寡糖生理功能的发现，β-甘露聚糖酶的需求量越来越大，导致对β-甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。但就国内外相关文献或专利报道来看，微生物β-甘露聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在众多领域中的广泛应用。为了提高β-甘露聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入90年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关β-甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但 有关来源于绿色木霉(Trichoderma viride)β-甘露聚糖酶基因的克隆和表达等的研究未见有报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新型β-甘露聚糖酶基因序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌的构建，以及重组β-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明来源于T.viride WL 0422的一种新型β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶的第5家族，命名为Tvi Man5A，其相应的基因命名为Tvi man5A。Tvi Man5A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。 

本发明的技术方案：一种源自T.viride WL 0422的新型β-甘露聚糖酶基因完整的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。 

T.viride WL 0422菌株由江南大学筛选和保藏，该菌株已于2006年在《江苏食品与发酵》杂志的No.1Pg.1公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。 

所述的重组β-甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。 

所述的重组β-甘露聚糖酶的活性测定方法： 

于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.8、乙酸-乙酸钠缓冲液配制的质量浓度为0.5％的角豆胶溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应10min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活性单位(IU)。