[发明专利]肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

说明书

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR试剂盒，特别是涉及利用实时荧光PCR技术检测肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)的试剂盒。试剂盒通过对样本中的肺炎克雷伯菌进行检测，可广泛应用于肺炎克雷伯菌感染的辅助诊断。

背景技术

肺炎克雷伯菌是临床上最常见的革兰阴性杆菌，是引起医院获得性泌尿系统感染、医院获得性肺炎和腹腔感染的重要病原体。同时，肺炎克雷伯菌也是社区获得性感染如社区获得性肺炎的潜在病原体。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)广泛分布于自然界及人和动物的胃肠道内，是临床标本中常见的细菌，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，可引起典型的原发性肺炎。肺炎克雷伯菌也能引起各种肺外感染，包括肠炎和脑膜炎(婴儿)、泌尿道感染(儿童和成人)及败血症。

典型的肺炎克雷伯杆菌肺炎常发生于中老年男性、长期饮酒的慢性支气管肺病患者，有较典型的临床表现和X线征象，结合痰培养结果，不难诊断。但在有严重原发疾病基础上的发病者，临床表现多不典型，诊断较为困难。凡在原有疾病过程中出现高热、白细胞和中性粒细胞增多，X线胸片上出现新的浸润病灶，而青霉素治疗无效者应考虑本病。连续2次或2次以上痰培养阳性，或胸腔积液、血培养阳性可以确诊。多数败血症患者的白细胞总数明显增多，嗜中性粒细胞增高；但血液病患者或用抗代谢药物者白细胞数可不增加，或反有减少。利用PCR方法可以直接检测病毒核酸，灵敏度更高。2008年1月，FDA通过第一个利用多重PCR方法，基于Luminex xTAG^TM技术，检测包括呼吸道合胞病毒在内的多种呼吸道病毒核酸检测试剂盒(xTAG^TM RVP试剂盒)[Mahony，J.，S.Chong，et al.(2007).″Development of a respiratory virus panel test for detection of twenty human respiratory viruses by use of multiplex PCR and a fluid microbead-based assay.″J Clin Microbiol 45(9)：2965-70]，该方法主要是在提取病毒核酸RNA或/和DNA后，经混合逆转录，再使用14对病毒特异引物进行多重PCR；扩增产物经处理，与含有tag序列的21对引物再进行多重靶特异引物延伸(TSPE)反应；其后，TSPE产物与标记有anti-tag序列的带不同荧光微球反应，通过Luminex 100流式细胞检测仪进行检测，记录并分析得到结果。

实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。实时荧光PCR只要加入模板和特异性引物即可实现在同一反应管内进行PCR反应，中途不需加入任何试剂，在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，设置了UNG酶+dUTP防污染措施有效地防范了PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，提高临床诊断依据的可靠性，并已在多个领域得到应用。与传统的PCR技术(终点检测)相比，实时定量监测方法具有如下优点：实现了低拷贝数靶多核苷酸的分析，特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点，而且实时荧光PCR可以得到更高的灵敏度，与传统的PCR技术(终点检测)技术相比，操作更简单，耗时更少，只需2小时即可完成全部检测。

本发明设计的试剂盒通过对KP核酸进行直接检测和研究，有利于加深对这种病毒的认识，不仅对于了解患病程度、预测、评价治疗效果有十分重要意义，而且使得病毒感染发病机制的研究进入量化阶段，为新药的研究与试用提供极为重要的研究手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实时荧光RT-PCR方法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒(下面简称KP试剂盒)，该试剂盒包括：(1)DNA提取液；PCR检测试剂：KP PCR反应液A、KP PCR反应液B；质控品：阴性质控品、KP阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为：

(1)针对肺炎克雷伯菌保守序列设计能够与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。

(2)寡核苷酸探针标记荧光发生基团，使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合。