[发明专利]一种重组E.coli Klenow酶的纯化方法

权利要求书

1.一种重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：由以下步骤组成：

1)破菌

表达重组E.coli Klenow片段的菌体，以1∶5～20的比例加入破菌缓冲液，搅拌10～20min使之混合均匀，在4～10℃下破碎菌体10～20min，再将得到的破菌液在10000～20000g下离心10～20min，温度控制在0～10℃，取其上清液；

破菌缓冲液为20～50mM Tris-HCl，PH7.5～8.5、0.1～5mMEDTA、0.5～1M NaCl、溶菌酶0.5～2mg/ml、加入PMSF至0.02～1mM；

2)两步盐析

第一步盐析的饱和度为40～50％：先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中缓慢加入，及时搅拌，加入比例为100ml破菌上清液加入22.6～29.1g硫酸铵，沉淀温度控制在0～10℃，时间大于2h，然后在10000～20000g下离心10～20min，离心温度控制在0～10℃，留取上清；

第二步盐析的饱和度为80～85％：先将硫酸铵盐用研钵研碎，向一级盐析上清中一次性加入，搅拌至完全溶解，加入比例为100ml破菌上清液加入51.6～55.9g硫酸铵，沉淀温度为0～10℃，时间大于2h，然后在10000～20000×g下离心10～20min，温度为0～10℃；

3)金属螯合亲和层析

金属螯合层析柱高为2.5～15cm，用缓冲液I平衡色谱柱3～5CV，上样量为每ml填料上样菌体蛋白100～300mg，上样线性流速为30～120cm/h，洗脱线性流速为100～300cm/h，上样后冲洗5～10CV，UV280洗至基线，缓冲液II洗脱杂蛋白5～10CV，UV280洗至基线，缓冲液III洗脱目的蛋白，收集UV280大于100mAu组分；

缓冲液I为20～50mM Tris-HCl，pH7.5～8.5、0.5～1M NaCl、5～10mM咪唑；缓冲液II为20～50mM Tris-HCl，PH7.5～8.5、0.5～1MNaCl、40～60mM咪唑；缓冲液III为20～50mM Tris-HCl，PH7.5～8.5、0.5～1M NaCl、250～350mM咪唑。色谱过程中温度维持在4～10℃；

4)凝胶过滤层析

凝胶柱高度为50～70cm，上样量为1％～5％，色谱过程中温度维持在4～10℃，上样流速10～30cm/h，洗脱流速20～60cm/h，收集UV280大于150mAu样品；

2.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：所述破菌步骤中，是用超声或高压均质的方法进行破菌。

3.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：所述金属螯合亲和层析中选用的介质配基为亚氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)。

4.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：所述金属螯合亲和层析步骤中上样量优选为每ml填料上样菌体蛋白100～200mg，上样线性流速优选为60～100cm/h，洗脱线性流速优选为100～150cm/h。

5.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：为避免外源核酸酶的污染，所有缓冲液、接触样品的容器、吸头等物品需要高压灭菌，色谱系统的管路、分子筛凝胶柱需要0.1～0.5M NaOH处理1h以上，金属螯合层析柱需要4～6M盐酸胍处理1h以上。

6.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：凝胶过滤层析介质为GE公司生产的Superdex 200、Sepharcyl200HR、Superose 12pg或Sepharose 6FF。

7.根据权利要求6所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：凝胶过滤层析介质优选为GE公司生产的Sepharcyl 200HR。

8.根据权利要求1所述的重组E.coli Klenow片段的纯化方法，其特征在于：其中凝胶过滤buffer为50mM Tris-HCl(pH 7.4)，0.2mM EDTA，2mM DTT。