[发明专利]一种重组E.coli Klenow酶的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物酶的纯化方法，特别涉及一种重组E.coli Klenow片段的纯化。 

背景技术

Klenow片段(克列诺片段，Klenow fragment，或称克列诺酶，Klenow enzyme)，分子量66～68KD，是E.coli DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。Klenow作为分子生物学的工具酶，应用十分广泛，主要为：1)补平由限制性内切核酸酶消化产生的3′凹端；2)通过放射性dNTP的掺入标记DNA片段的3′端；3)用随机引物法标记单链DNA；4)用引物延伸法合成单键探针。 

因此Klenow片段具有较高的市场价值，但国内生产的Klenow片段品质普遍不高，表现为蛋白纯度较低，一般小于90％，含有干扰酶活的杂质，使用此类酶可能导致实验的失败。国外公司生产的Klenow片段品质较高，但其生产工艺繁琐，成本较高，售价昂贵。 

1991年美国学者Catherrine M.Joyce报导的Klenow纯化方法包括：破菌、50％盐析、85％盐析、Mono Q离子交换层析、Phenyl-Superose疏水层析、Superose 12凝胶层析，其中的Phenyl纯化步骤主要用来去除微量的核酸酶。1993年美国学者Victoria Derbyshire报道Klenow纯化方法包括了类似的步骤：破菌、40％盐析、85％盐析、Mono Q离子交换层析、Phenyl-Superose疏水层析、Superose 12凝胶层析， 仅第一级盐析的饱和度略有调整。1997年Yang Xu也采用了类似的纯化工艺。目前国外大公司生产Klenow的纯化一直沿用此类纯化方法，即破菌、两步盐析、离子层析、疏水层析、凝胶层析。为达到酶的商品浓度，常常还需要增加浓缩步骤，并且需要透析或超滤等方法将酶更换至相应的储液buffer，这进一步增加了工艺的复杂性和高成本性。因此建立简便、快速、高质量、低成本的工业化可行的Klenow纯化方法是十分必要的。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组E.coli Klenow片段的纯化方法。此方法具有工艺简便、快速，获得的Klenow片段质量高、成本低的特点，十分适合工业放大生产。 

本发明采用以下的技术方案： 

一种重组E.coli Klenow片段的纯化方法，由以下步骤组成： 

1)破菌 

表达重组E.coli Klenow片段的菌体，以1∶5～20的比例加入破菌buffer，搅拌10～20min使之混合均匀，在4～10℃下破碎菌体10～20min，再将得到的破菌液在10000～20000g下离心10～20min，温度控制在0～10℃，取其上清液； 

其中破菌缓冲液为20～50mM Tris-HCl，pH7.5～8.5、0.1～5mMEDTA、0.5～1M NaCl、溶菌酶0.5～2mg/ml、加入PMSF至0.02～1mM； 

所述破菌步骤中，是用超声或高压均质的方法进行破菌，对于破菌规模大于200ml优选高压均质法，具体是：将菌体和破菌buffer 的混合液放入高压均质机中，在0～10℃、工作压力为500～800bar时均质2～3遍。小体积可以选择超声法，具体是将菌体和破菌buffer的混合液放入超声设备中，超声5～10s，停10～20s，共超声10～20min，此超声方法建议体积小于0.2L时使用。 

2)两步盐析 

第一步盐析的饱和度为40～50％，具体操作为：先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中缓慢加入，及时搅拌，确保不会出现局部浓度过高，加入的比例为100ml破菌上清液加入22.6～29.1g硫酸铵，沉淀温度控制在0～10℃，时间大于2h，然后在10000～20000g下离心10～20min，离心温度控制在0～10℃，留取上清； 

第二步盐析的饱和度为80～85％，具体操作为：先将硫酸铵盐用研钵研碎，向一级盐析上清中一次性加入，搅拌至完全溶解，加入比例为100ml破菌上清液加入51.6～55.9g硫酸铵，沉淀温度为0～10℃，时间大于2h，最好过夜，这样可以充分沉淀目的蛋白，提高收率且便于离心澄清，然后在10000～20000g下离心10～20min，温度为0～10℃，也可以将离心沉淀按金属螯合层析每批处理量分装并冷冻保存。 

4)金属螯合亲和层析